Endozytose

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 5524 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Es wird allgemein angenommen, dass der horizontale Gentransfer in Bakterien über Konjugation, Transduktion und Transformation erfolgt. Diese Mechanismen erleichtern mithilfe hochentwickelter Maschinen den Durchgang der DNA durch die schützende Zellwand. Hier berichten wir, dass Bakterien mit Zellwandmangel DNA und anderes extrazelluläres Material über einen Endozytose-ähnlichen Prozess verschlingen können. Konkret zeigen wir, dass L-Formen des filamentösen Actinomyceten Kitasatospora viridifaciens Plasmid-DNA, Polysaccharide (Dextran) und 150-nm-Lipid-Nanopartikel aufnehmen können. Der Prozess beinhaltet eine Einstülpung der Zytoplasmamembran, was zur Bildung intrazellulärer Vesikel führt, die extrazelluläres Material einkapseln. Die DNA-Aufnahme wird durch die Deletion von zu comEC und comEA homologen Genen, die für die natürliche Transformation in anderen Arten erforderlich sind, nicht beeinträchtigt. Allerdings wird die Aufnahme durch Natriumazid oder Inkubation bei 4 °C gehemmt, was darauf hindeutet, dass der Prozess energieabhängig ist. Die eingekapselten Materialien werden beim Abbau der Vesikelmembran in das Zytoplasma freigesetzt. Da zellwanddefiziente Bakterien als Modell für frühe Lebensformen gelten, deckt unsere Arbeit einen möglichen Mechanismus auf, nach dem sich Urzellen vor der Erfindung der bakteriellen Zellwand Nahrung oder genetisches Material aneignen.

Bakterien sind ständig wechselnden Umweltbedingungen ausgesetzt und verlassen sich zum Schutz auf ihre Zellhülle. Die Zellhülle besteht aus einer Zellmembran und einer Zellwand, um die innere von der äußeren Umgebung zu trennen. Die Zellmembran ist eine Phospholipid-Doppelschicht, die das Zytoplasma umschließt und als selektive Barriere fungiert. Die Zellwand besteht für grampositive Bakterien aus einer dicken Peptidoglycanschicht (PG) und für gramnegative Bakterien aus einer dünneren PG-Schicht, die von einer Außenmembran umgeben ist. Die Peptidoglycanschicht ist eine wichtige netzartige Struktur, die nicht nur Schutz vor mechanischer Belastung und Turgordruck bietet, sondern auch die Zellform und -steifigkeit definiert.

Um die selektive Passage von Makromolekülen durch die Zellhülle zu erleichtern, haben Bakterien spezielle und hochentwickelte Transportsysteme entwickelt1. Beispielsweise sind natürlich transformierbare Bakterien für die DNA-Aufnahme auf Proteinkomplexe angewiesen, deren Komponenten den Pili-Systemen vom Typ IV oder Sekretionssystemen vom Typ II ähneln. Der aktive Transport von DNA durch die Zellwand wird durch das Zurückziehen von Pilusstrukturen erleichtert, die DNA binden2,3. Anschließend werden DNA-bindende und porenbildende Proteine ​​verwendet, um die DNA durch die Zellmembran zu transportieren.

Obwohl die Zellwand für die meisten Bakterien eine lebenswichtige Struktur ist, fehlt einigen Bakterien von Natur aus eine Zellwand oder sie können unter bestimmten Bedingungen ihre Zellwand abwerfen. Beispiele hierfür sind die Mitglieder der Mollicutes, die parasitisch sind und in spezifischen osmotisch schützenden Umgebungen leben, wie z. B. menschlichen Schleimhautoberflächen oder den Phloem-Siebröhren von Pflanzen4. Bei längerer Einwirkung von Umweltstressoren wie zellwandschädigenden Wirkstoffen entstehen sogenannte L-Formen, das sind Zellen, die sich ohne ihre Zellwände vermehren können. Die Reproduktion von L-Formen erfolgt unabhängig von der kanonischen FtsZ-basierten Teilungsmaschinerie5 und wird durch ein Ungleichgewicht im Oberflächen-Volumen-Verhältnis der Zellen angetrieben, das durch die Hochregulierung der Membransynthese verursacht wird, was zu spontaner Blasenbildung, Tabulation und Bläschenbildung führt6,7. Diese primitiven zellähnlichen Eigenschaften machen L-Formen zu einem attraktiven Modellsystem zur Untersuchung der Entwicklung des frühen Lebens8,9.

Einige filamentöse Actinomyceten, wie die myzelbildenden Kitasatospora viridifaciens, haben die Fähigkeit, ihre Zellwand unter Bedingungen von hyperosmotischem Stress vorübergehend abzustoßen (Abb. 1a)7. Im Gegensatz zu L-Formen sind S-Zellen nicht in der Lage, sich ohne ihre Zellwand zu vermehren, obwohl diese Zellen nach dem Wiederaufbau ihrer Zellwand in den Myzel-Wachstumsmodus zurückkehren können. Temporäre Zellen mit Zellwandmangel können auch künstlich aus Bakterien mit Zellwand erzeugt werden, indem die Zellwand enzymatisch entfernt wird, beispielsweise durch die Wirkung von Lysozym, das Peptidoglycan abbaut. Dies führt zur Bildung von Protoplasten oder Sphäroplasten, die häufig für gentechnische Zwecke verwendet werden, wobei häufig Polyethylenglykol (PEG) verwendet wird, um den DNA-Eintritt in die Zelle zu ermöglichen10. Obwohl es sich bei dieser PEG-basierten Transformation um eine weit verbreitete Technik zur Transformation filamentöser Actinomyceten handelt, konnte nie eindeutig gezeigt werden, ob K. viridifaciens-wandige Zellen oder ihre natürlichen Zellwand-defizienten Zellen zu einer natürlichen genetischen Transformation ohne Verwendung von PEG fähig sind. Wie sich das Fehlen der Zellwand auf die natürliche Aufnahme von Makromolekülen wie DNA aus der Umgebung auswirkt, ist unbekannt.

a Schematische Darstellung der Entstehung zellwanddefizienter Zellen von K. viridifaciens. Zu den vorübergehenden Zellen mit Wanddefizit gehören Protoplasten, die durch die Wirkung von Lysozym aus Myzelzellen gewonnen werden, und S-Zellen, die in einem Medium mit hohem osmotischem Druck aus den Hyphenspitzen extrudiert werden. Dauerhaft wanddefiziente L-Formen werden nach längerer Inkubation des Myzels unter hohem osmotischem Druck (Linie M1) mit optionaler Ergänzung von Lysozym (Lys) und Penicillin G (PenG) (Linien Alpha und Delta) erzeugt. b Myzel (n = 3), Protoplasten (n = 5 aus zwei Experimenten), S-Zellen (n = 7 aus zwei Experimenten) und L-Form-Linien Alpha (n = 3 für sowohl 4 als auch 6 Tage alte Zellen ), Delta (n = 2 für 3 und 7 Tage alte Zellen) und M1 (n = 1 für 3 Tage alte Zellen) wurden 18–24 Stunden lang mit Plasmid-DNA (pRed*) inkubiert und aufplattiert Selektivmedium gewaschen und bei 30 °C inkubiert, um nach transformierten Zellen zu selektieren. Es wird eine Nahaufnahme der Koloniemorphologie der L-Formen gegeben. Maßstabsbalken zeigen 1 mm an. Beachten Sie, dass nur L-Formen eine konsistente DNA-Aufnahme zeigen. c Polyethylenglykol (PEG)-basierte Transformationseffizienz von K. viridifaciens-Myzel, Protoplasten, S-Zellen und L-Formen unter Verwendung von Plasmid-DNA (pRed*), angegeben als Prozentsatz der transformierten Kolonien. n = 3 biologische Replikate mit Ausnahme von S-Zellen (n = 4). d Transformationseffizienz von 7 Tage altem Alpha und AlphaΔcomEA/EC nach 24-stündiger Inkubation mit pFL-ssgB. CFU = koloniebildende Einheiten. ns = nicht signifikant (n = 5 biologische Replikate, zweiseitiger unabhängiger t-Test, t(8)=1,572, P = 0,155). e Transformationseffizienz von 1, 3 und 7 Tage altem Alpha nach 24-stündiger Inkubation mit pFL-ssgB. Sternchen (**) zeigen P ≤ 0,01 an (n = 4 biologische Replikate, einfaktorielle ANOVA, F (2, 9) = 12,16, Tukey-Post-hoc-Test, P = 0,006 (1–3 Tage) und 0,005 (1–7). Tag)). f Transformationseffizienz von 7 Tage altem Alpha, inkubiert mit pRed* für 6, 24 oder 48 Stunden. Ein Sternchen (*) zeigt einen statistisch signifikanten Unterschied zwischen 6- und 24-stündiger Inkubation an (zweiseitiger Kruskal-Wallis-Test, H(2) = 8,769, P = 0,012; Dunns paarweiser Test, einschließlich Bonferroni-Korrektur, ergibt P = 0,010 für 6 und 24 Stunden, P = 0,233 für 6 und 48 Stunden und P = 0,718 für 24 und 48 Stunden). ns nicht signifikant. n = 4 biologische Replikate. g Generalisierte Polarisation (GP) als Messung der Membranfluidität von 1, 3 und 7 Tage alten Alpha unter Verwendung des Membranfarbstoffs Laurdan. Ein niedrigerer GP weist auf eine höhere Membranfluidität hin. n = 3 biologische Replikate. Die Daten in (c–g) werden als Mittelwert ± SD mit einzelnen Datenpunkten dargestellt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

In dieser Arbeit zeigen wir, dass L-Formen des filamentösen Actinomyceten K. viridifaciens DNA unabhängig von der kanonischen natürlichen genetischen Transformationsmaschinerie aufnehmen können. Stattdessen wird die Aufnahme durch einen Mechanismus des horizontalen Gentransfers erleichtert, der die Einstülpung der Zellmembran beinhaltet, was zur Bildung innerer Vesikel führt. Darüber hinaus zeigen wir, dass dieser Mechanismus robust ist und auch die unspezifische Aufnahme anderer Makromoleküle aus der Umgebung ermöglicht. Da L-Formen als Modell für frühes Zellleben gelten, liefert unsere Arbeit Erkenntnisse darüber, wie solche alten Zellen möglicherweise große Biomoleküle und Nanopartikel aus der Umwelt aufgenommen haben, ohne dass komplexe Transportmaschinen erforderlich waren.

Es ist nicht bekannt, ob ummauerte oder wandlose Zellen von K. viridifaciens zu einer natürlichen genetischen Transformation fähig sind. Um dies zu analysieren, wurden ummauerte Myzelzellen, temporäre wandlose S-Zellen und Protoplasten sowie dauerhaft wandlose L-Formen (Alpha) frisch geerntet und in einem osmotisch stabilen LPB-Medium resuspendiert. Anschließend wurden die Zellen 18–24 Stunden lang mit Plasmid-DNA (pRed*), die eine Antibiotikaresistenzkassette enthielt, inkubiert und auf selektiven und nichtselektiven Medien ausplattiert, um den Nachweis transformierter Zellen zu ermöglichen. Bemerkenswert ist, dass L-Formen im Gegensatz zu Myzel, Protoplasten und S-Zellen durchgehend in der Lage waren, DNA aufzunehmen (Abb. 1b). Die DNA-Aufnahme war nicht auf eine L-Form-Linie beschränkt, sondern wurde bei verschiedenen L-Form-Zelllinien beobachtet, die aus ummauerten Zellen von K. viridifaciens gewonnen wurden, die in LPB-Medium mit (Linien Alpha und Delta) oder ohne (Linie M1) Penicillin und Lysozym gezüchtet wurden7 ,11. Mit Alpha wurden keine Transformanten erhalten, wenn intakte oder fragmentierte genomische DNA verwendet wurde oder wenn methyliertes Plasmid verwendet wurde (ergänzende Abbildung 1a, b). Während die natürliche genetische Transformation auf L-Formen beschränkt war, konnten alle Zellen mit Wanddefizit mithilfe von Polyethylenglykol (PEG) chemisch transformiert werden, wobei Protoplasten, S-Zellen und L-Formen eine durchschnittliche Transformationseffizienz zwischen 1,7 und 2,5 % aufwiesen (Abb . 1c). Die Zugabe von PEG ermöglichte auch die Transformation von Alpha mit genomischer DNA, selbst wenn diese in einem rohen Zellextrakt vorhanden war (ergänzende Abbildung 1c). Andererseits verhinderte die Verwendung methylierter DNA die chemische Transformation, was darauf hindeutet, dass eine PEG-basierte Transformation mit verschiedenen DNA-Typen möglich ist, jedoch durch das Vorhandensein eines unterschiedlichen Methylierungsmusters begrenzt ist. Im Gegensatz dazu konnten ummauerte Zellen weder mit noch ohne PEG transformiert werden (Abb. 1b, c). Diese Ergebnisse zeigen, dass L-Formen unter diesen Bedingungen im Gegensatz zu ummantelten Zellen, S-Zellen und Protoplasten auf natürliche Weise DNA aufnehmen können.

Natürlich transformierbare Bakterien nutzen eine spezielle DNA-Translokationsmaschinerie mit Ähnlichkeiten zu Typ-IV-Pili- oder Typ-II-Sekretionssystemen, um externe DNA2 aufzunehmen. Ähnliche Komponenten dieses kanonischen Systems könnten auch an der DNA-Aufnahme durch L-Formen beteiligt sein. Eine BlastP-Suche mit dem DNA-bindenden Protein ComEA und dem Kanalprotein ComEC des natürlich transformierbaren Bakteriums Bacillus subtilis str. 168 gegen K. viridifaciens ergab zwei signifikante Treffer: BOQ63_029625 (Helix-Haarnadel-Helix-Domäne enthaltendes Protein) und BOQ63_029630 (Kompetenzprotein der ComEC / Rec2-Familie) (Ergänzungstabelle 1 und Ergänzungsabbildung 1d). Die B. subtilis-Helikase/DNA-Translokase ComFA führte zu einem Treffer auf ein mutmaßliches Mfd-kodierendes Gen (BOQ63_020315), ein weithin konserviertes bakterielles Protein, das die transkriptionsgekoppelte DNA-Reparatur vermittelt12. Es wurden keine anderen Orthologen gefunden, die mit Proteinen korrelieren, die am DNA-Transport durch die Zellhülle von B. subtilis, der gramnegativen Neisseria gonorrhoeae13 oder dem T4SS-bezogenen DNA-Aufnahmesystem von Helicobacter pylori14 beteiligt sind (Ergänzungstabelle 1). Den L-Formen fehlt eine intakte Zellwand auf Peptidoglycan-Basis, weshalb die DNA zur Internalisierung nur die Zellmembran passieren muss. In natürlich transformierbaren Bakterien wirken ComEA und ComEC beim DNA-Transport durch die Zellmembran13,15,16. Obwohl die Rolle der mutmaßlichen comEC- und comEA-Gene in K. viridifaciens unbekannt ist, da seine ummantelten Zellen keine DNA-Aufnahme zeigten, fragten wir uns, ob diese Proteine ​​an der DNA-Aufnahme in L-Formen beteiligt sein könnten. Daher haben wir die mutmaßlichen comEC- und comEA-Gene im L-Form-Stamm Alpha durch eine Apramycin-Resistenzkassette ersetzt (ergänzende Abbildung 1d, e). Bemerkenswerterweise hatte die gleichzeitige Löschung der comEA- und comEC-Gene keinen Einfluss auf die Transformationseffizienz (zweiseitiger unabhängiger t-Test, t(8) = 1,572, P = 0,155), was darauf hindeutet, dass die DNA-Aufnahme durch L-Formen unabhängig von den Genen erfolgt homolog zu dieser kanonischen DNA-Translokationsmaschinerie (Abb. 1d).

Die Fähigkeit, DNA für die natürliche Transformation aufzunehmen, wird bei natürlich transformierbaren Bakterien unterschiedlich reguliert und kann konstitutiv aktiv oder auf eine bestimmte Wachstumsphase beschränkt sein, wie von Blokesch (2016)17 überprüft. Einer der Faktoren, die die Entwicklung der Kompetenz zur DNA-Aufnahme bei B. subtilis steuern, ist die Wachstumsphase18,19. Um zu untersuchen, ob das Kulturalter auch die DNA-Aufnahmefähigkeit von L-Formen beeinflusst, wurden Zellen aus Kulturen unterschiedlichen Alters einem Transformationstest unterzogen. Zellen aus 1 Tag alten Alpha-Kulturen nehmen DNA leichter auf als aus 3 oder 7 Tage alten Kulturen (einfaktorielle ANOVA, F (2,9) = 12,16, Tukey Post-Hoc-Test, P = 0,006 und 0,005) (Abb. 1e). Um zu testen, ob kürzere oder längere Inkubationszeiten die DNA-Aufnahme beeinflussen, wurde die Transformationseffizienz von 7 Tage altem Alpha nach 6-, 24- und 48-stündiger Inkubation mit DNA bestimmt (Abb. 1f). Die Transformation wurde nach 6-stündiger Inkubation festgestellt und nahm nach 24 Stunden zu (zweiseitiger Kruskal-Wallis-Test, H(2) = 8,769, P = 0,012 und Dunns paarweiser Test mit Bonferroni-Korrektur ergibt P = 0,010 für 6 und 24 Stunden, P = 0,233 für 6 und 48 Stunden und P = 0,718 für 24 und 48 Stunden). Es ist nicht unwahrscheinlich, dass Unterschiede in den Membraneigenschaften, die während des Zellwachstums auftreten, wiederum die DNA-Aufnahmefähigkeit beeinflussen können. Die Membranfluidität ist ein Maß für die durchschnittliche Viskosität der Lipiddoppelschicht, die die Positionierung und Bewegung von Proteinen und Lipiden innerhalb der Membran beeinflussen kann20. Eine höhere Membranfluidität ist durch eine erhöhte Störung der Fettsäuren, eine geringere Lipidpackung und höhere Diffusionsraten gekennzeichnet, was zu einer erhöhten Membranpermeabilisierung führen kann21,22. Die Analyse der Membranfluidität der Kulturen unterschiedlichen Alters zeigte, dass die erhöhte Fähigkeit zur DNA-Aufnahme möglicherweise positiv mit der Fluidität der Membran korreliert, wie aus der allgemeinen Polarisation abgeleitet wird (GP, ein niedrigerer GP weist auf eine höhere Fluidität hin)23 (Abb. 1g). obwohl keine statistisch signifikanten Unterschiede beobachtet wurden (Einfaktorielle ANOVA nach Welch, F(2, 2,798) = 13,226, P = 0,038, mit Games-Howell-Post-hoc-Test: 1–3 Tage P = 0,068; 1–7 Tage P = 0,134 ; 3–7 Tage P = 0,711, n = 3). Eine relativ geringe Fluidität könnte erklären, warum temporäre Protoplasten und S-Zellen mit Wanddefizit DNA nicht auf natürliche Weise aufnehmen können. Die Fließfähigkeit der Protoplasten lag jedoch im Bereich von 1 bis 7 Tage alten Kulturen, gemessen mit einem Plattentest (ergänzende Abbildung 2a). Die anschließende Analyse des GP durch fluoreszenzmikroskopische Bildgebung zeigte, dass Protoplasten und S-Zellen zwar tendenziell weniger flüssige Membranen aufweisen, diese Werte jedoch im Bereich der Membranflüssigkeit von 1 bis 7 Tage alten L-Formen bleiben (ergänzende Abbildung). 2b). Obwohl die Membranfluidität zur effizienten DNA-Aufnahme beitragen kann, reicht sie daher nicht aus, um diesen Prozess zu erklären.

Um den Mechanismus, der die DNA-Aufnahme durch L-Formen erleichtert, weiter zu untersuchen, fügten wir Cy5-markierte Plasmid-DNA zu L-Formen hinzu, die zytoplasmatisches eGFP exprimieren. Nach drei Tagen Inkubation wurde markierte Plasmid-DNA entweder auf der Außenseite der L-Form-Zellmembran oder in einem scheinbaren inneren Vesikel gefunden (Abb. 2a, Zusatzfilm 1 und Kontroll-Zusatzfilm Abb. 3a). Da diese inneren Vesikel kein eGFP enthielten, gingen wir davon aus, dass sie durch einen Einstülpungsprozess der Membran entstanden sein könnten, bei dem extrazelluläres Material in den Vesikeln eingeschlossen wird. Um dies direkt zu testen, inkubierten wir eGFP-exprimierende L-Formen mit dem Fluoreszenzfarbstoff SynapseRed C2M (SynapseRed). Angesichts der Tatsache, dass Styrylfarbstoffe wie SynapseRed (entspricht FM5-95) nicht durch Zellmembranen diffundieren können24,25, wäre jedes Fluoreszenzsignal auf den Membranen, die innere Vesikel umgeben, ein starkes Argument dafür, dass solche Vesikel von der Zellmembran stammen. Tatsächlich wurde festgestellt, dass SynapseRed nach einer Inkubation über Nacht nicht nur die Zellmembran der L-Formen, sondern auch die Membranen der inneren Vesikel anfärbt (Abb. 2b). Die Färbung mit SYTO 9 zeigte außerdem, dass chromosomale DNA im Zytoplasma vorhanden war, jedoch nicht in inneren Vesikeln (Abb. 2c). Die Inkubation von Protoplasten, die zytoplasmatisches eGFP produzieren, mit SynapseRed zeigte, dass Bereiche mit geringerer zytoplasmatischer eGFP-Fluoreszenz durch das Vorhandensein interner Membranstrukturen und nicht durch die Bildung interner Vesikel verursacht wurden (Abb. 2d). Eine ähnliche Inkubation von S-Zellen zeigte das Vorhandensein interner vesikelartiger Strukturen ohne zytoplasmatisches eGFP. Anders als bei den L-Formen zeigte die anschließende Färbung von S-Zellen, die zytoplasmatisches mCherry produzieren, mit SYTO 9 jedoch, dass diese dunklen Regionen mit chromosomaler DNA gefüllt waren. Da es sich bei SynapseRed um einen membranundurchlässigen Farbstoff handelt, spiegelt die Färbung von Membranstrukturen in S-Zellen möglicherweise eine erhöhte Membranpermeabilität statt einer Färbung aufgrund der Einstülpung der Zellmembran wider. Um die Diffusion des Farbstoffs durch die Zellmembran zu testen, wurden L-Formen und S-Zellen mit SynapseRed bei 30 °C und bei 4 °C inkubiert, um eine mögliche Membraninvagination zu ermöglichen bzw. zu verhindern. Während die innere Membran in S-Zellen sowohl bei 30 ° C als auch bei 4 ° C gefärbt war, wurde dies bei L-Formen nur bei 30 ° C beobachtet (ergänzende Abbildung 3b). Dies legt nahe, dass die Färbung einer Membran in S-Zellen durch SynapseRed auf der Durchlässigkeit der Zellmembran für den Farbstoff beruht, im Gegensatz zu L-Formen, bei denen die Färbung auf eine Einstülpung der Zellmembran zurückzuführen ist.

a Repräsentative Fluoreszenzmikroskopaufnahme von Alpha-pIJ82-GFP (zytoplasmatisches eGFP; grün), inkubiert mit Cy5-markierter Plasmid-DNA (pFL-ssgB; Magenta) für 3 Tage (n = 3 Beobachtungen aus einem Experiment). BF-Hellfeld. Siehe auch Zusatzfilm 1. b Inkubation von alpha pIJ82-GFP nach Inkubation über Nacht mit dem membranundurchlässigen Farbstoff SynapseRed C2M (SynapseRed; Magenta), zeigt zwei Z-Schnitte auf unterschiedlichen Höhen einer L-Form-Zelle. Gezeigt wird eine repräsentative mikroskopische Aufnahme von sechs Beobachtungen aus einem Experiment. c Repräsentative mikroskopische Aufnahme von Alpha (n = 7 Beobachtungen aus einer Inkubation) und Alpha-pRed* (n = 9 Beobachtungen aus einer Inkubation), gefärbt mit SYTO 9 (grün), um chromosomale DNA anzuzeigen. Alpha wird mit SynapseRed C2M (SynapseRed; Magenta) gefärbt, um Zellmembranen sichtbar zu machen, wohingegen (das Fehlen von) zytoplasmatischem mCherry für Alpha pRed* (Magenta) das Vorhandensein eines inneren Vesikels anzeigt. Die Zellen wurden direkt nach der Zugabe der Fluoreszenzfarbstoffe abgebildet. d Repräsentative Bilder von Protoplasten und S-Zellen von K. viridifaciens pIJ82-GFP, das zytoplasmatisches eGFP produziert, 72 Stunden lang mit SynapseRed (SR) inkubiert (obere Reihen, mindestens sechs Beobachtungen aus zwei unabhängigen Experimenten mit S-Zellen und Protoplasten) und S -Zellen von K. viridifaciens pRed*, die zytoplasmatisches mCherry produzieren, 72 Stunden lang mit SynapseRed und SYTO 9 inkubiert (untere Reihe, drei Beobachtungen aus einem Experiment). Beachten Sie, dass das Vorhandensein interner Membranstrukturen und/oder DNA zu einer Verringerung der zytoplasmatischen Fluoreszenzemission führen kann. e Standbilder eines 950-minütigen Zeitraffer-Bildgebungsexperiments von Alpha-produzierendem DivIVA-eGFP (Alpha-pKR2) (grün), inkubiert mit 3 kDa Dextran-Texas Red (D-TR; Magenta) (n = 1). Pfeile zeigen die Lokalisierung von DivIVA-eGFP an. Siehe auch Zusatzfilm 2. f Repräsentative Mikroaufnahme der Bildung von Herden und Ringstrukturen von DivIVA-eGFP in Alpha-pKR2 (grün) nach Inkubation über Nacht mit D-TR (magenta) (mehr als 50 Beobachtungen aus einem Experiment). Beachten Sie, dass L-Formen in der Lage sind, fluoreszierend gefärbte DNA und Dextran durch die Bildung interner Vesikel aufzunehmen. g Transformationseffizienz von 7 Tage altem Alpha und AlphaΔdivIVA unter Verwendung von pFL-ssgB. ns nicht signifikant (zweiseitiger unabhängiger t-Test, t(8) = 0,489, P = 0,638). CFU-Koloniebildende Einheiten. Die Daten wurden als Mittelwert ± SD mit einzelnen Datenpunkten dargestellt, n = 5 biologische Replikate. h L-Formen ohne DivIVA können interne Vesikel produzieren, wie für 5 Tage altes alphaΔdivIVA pIJ82-GFP gezeigt, das zytoplasmatisches eGFP produziert (n = 2 Beobachtungen aus einer Kultur). Maßstabsbalken zeigen 2 μm an. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um das Vorhandensein mutmaßlicher interner Vesikelstrukturen in den verschiedenen Zelltypen zu vergleichen, wurde der Prozentsatz der L-Formen, Protoplasten und S-Zellen mit diesen Strukturen quantifiziert. Zellen, die zytoplasmatisches mCherry produzieren (Alpha-pRed* oder S-Zellen und Protoplasten, die von K. viridifaciens pRed* stammen), wurden 0 und 3 Tage lang mit SynapseRed inkubiert, um Membranen anzufärben. Die DNA wurde vor der Bildgebung mit SYTO 9 sichtbar gemacht. Die Anzahl der Zellen mit Regionen ohne Fluoreszenzemission aus dem Zytoplasma, der DNA und der Membran, die auf das Vorhandensein interner Vesikel hinweisen könnten, wurde quantifiziert (Ergänzungstabelle 2). Mit dieser Methode kommt es bei L-Formen etwa 6- bis 11-fach häufiger zu solchen Regionen als bei S-Zellen (L-Formen: 24,5 und 14,7 %; S-Zellen: 2,2 und 2,6 % nach 0 und 3 Tagen Inkubation, bzw.) und mutmaßliche Vesikel wurden bei Protoplasten selten beobachtet (<0,5 %). Wenn diese Regionen in S-Zellen und Protoplasten tatsächlich innere Vesikel wären, reicht ihr Vorkommen wahrscheinlich nicht aus, um eine konsistente Transformation mit DNA nachzuweisen. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse stark darauf hin, dass die beobachteten Vesikel in L-Formen von der Einstülpung der Zellmembran herrühren, wodurch extrazelluläre DNA in solchen Vesikeln eingeschlossen werden kann, während dies bei S-Zellen und Protoplasten nicht offensichtlich ist.

Bei Eukaryoten ist Endozytose ein Prozess, der die Aufnahme externer Ladung über die Bildung interner Vesikel ermöglicht, die schließlich abgebaut oder recycelt wird26,27. Fluoreszenzmarkierte Dextrane werden häufig als Marker für die Endozytose in Eukaryoten verwendet, da sie die Zellmembran nicht passieren können28,29. Um festzustellen, ob ein solcher Endozytose-ähnlicher Prozess in L-Formen vorhanden sein könnte, und um die Aufnahme externer Materialien sichtbar zu machen, haben wir die Zellen mit Dextran-Texas Red (D-TR) inkubiert und eine Zeitrafferaufnahme durchgeführt. Der verwendete L-Form-Stamm exprimiert auch DivIVA-eGFP, das eine starke Affinität zu negativ gekrümmten Membranregionen (alpha pKR2)30 aufweist. Man geht davon aus, dass sich solche Regionen bei der Einstülpung der Membran bilden. Nach 290-minütiger Inkubation war D-TR in der L-Form sichtbar und neben dieser Region begannen schwache Flecken von DivIVA-eGFP zu erscheinen (Abb. 2e und Zusatzfilm 2). Dies führte zu einer deutlichen Ausbeulung der Zellmembran nach innen mit zwei DivIVA-eGFP-Herden auf beiden Seiten der einstülpenden Membran und einem Einstrom von D-TR (t = 560 min). Nach 640 Minuten bildete sich ein inneres Vesikel, das D-TR enthielt. In anderen Zellen schien DivIVA-eGFP eine ringförmige Struktur zu bilden, die manchmal die einstülpende Membran umhüllte (Abb. 2f, Zelle 1 und 2). Das Vorhandensein von DivIVA in der Nähe der Einstülpungsstelle deutet auf das Vorhandensein negativ gekrümmter Bereiche in der Membran hin. Insbesondere ist DivIVA für die Vesikelbildung oder DNA-Aufnahme nicht erforderlich, da die Deletion von divIVA (alphaΔdivIVA) keinen Einfluss auf die Transformation hatte (zweiseitiger unabhängiger t-Test, t(8) = 0,489, P = 0,638) (Abb. 2g). ) und innere Vesikel wurden von diesem Stamm immer noch gebildet (Abb. 2h). Darüber hinaus wurde die Internalisierung von D-TR auch in L-Formen beobachtet, die DivIVA-eGFP nicht exprimierten, was darauf hinweist, dass die Aufnahme keine Folge der Anwesenheit des Fusionsproteins ist (ergänzende Abbildung 3c). Die Inkubation von Protoplasten und S-Zellen mit D-TR bis zu 72 Stunden führte nicht zu einer klaren D-TR-Einkapselung in inneren Vesikeln (ergänzende Abbildung 3d). Um dies zu quantifizieren, wurden Zellen, die zytoplasmatisches eGFP produzieren, 72 Stunden lang mit D-TR oder PBS inkubiert. Der Prozentsatz der Zellen mit Regionen ohne eGFP, die aber D-TR in dieser Region enthielten, wurde gezählt. Wiederholte Inkubation (in Duplo) führte zur Aufnahme von D-TR in etwa 6 % der L-Form-Zellen und zu keiner Aufnahme bei der Kontrolle mit PBS (Ergänzungstabelle 3). Bei mit D-TR inkubierten S-Zellen und Protoplasten wurde im Vergleich zu mit PBS inkubierten Kontrollzellen keine deutliche Aufnahme beobachtet (S-Zellen: 0,9 und 1,7 % mit D-TR gegenüber 0 und 2,1 % mit PBS; Protoplasten: 0 und 1,1). % mit D-TR gegenüber 0 und 0,8 % mit PBS). Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass die Invagination der Zellmembran von L-Formen zur Bildung interner Vesikel führen kann und möglicherweise einen Endozytose-ähnlichen Mechanismus darstellt, der die Aufnahme von Molekülen, einschließlich DNA, aus der Umgebung ermöglicht.

Lipid-Nanopartikel (LNPs) sind nicht-virale Partikel, die zur Abgabe von Nukleinsäuren und Medikamenten an menschliche Zellen über Endozytose31 verwendet werden. LNPs haben keine Lipiddoppelschichtstruktur, sondern bestehen aus einem elektronendichten, hydrophoben Lipidkern, der Nukleinsäuren durch elektrostatische Wechselwirkungen einkapselt und von einer Schicht aus PEG-Lipiden umgeben ist31. Internalisierte LNPs befinden sich in Endosomen, bei denen es sich um membrangebundene Organellen des Endozytosewegs handelt. Durch die anschließende Ansäuerung werden die ionisierbaren Lipide der LNPs positiv geladen, was es dem LNP ermöglicht, die endosomale Membran zu destabilisieren und seine Ladung in die Zelle zu transportieren. LNPs können auch durch den Einbau von Fluorophor-konjugierten Phospholipiden fluoreszierend markiert werden. Um die Fähigkeit von L-Formen, große externe Partikel aufzunehmen, weiter zu untersuchen, wurden die Zellen mit Rhodamin-markierten LNPs (LNP-LR, enthaltend 18:1 Liss Rhod PE) mit einer durchschnittlichen Größe von 150 nm inkubiert, um ihren Nachweis zu ermöglichen innerhalb von L-Formen. Nach Zugabe von LNP-LR zu 7 Tage alten L-Formen konnte nach Inkubation über Nacht ein deutliches Fluoreszenzsignal im Inneren der Zellen nachgewiesen werden, das wahrscheinlich von mehreren LNP-Partikeln erzeugt wurde, sowie die Lokalisierung von LNPs auf der Zellmembran (Abb. 3a und ergänzende Abb. 4a, b). Wenn L-Formen verwendet wurden, die eGFP im Zytoplasma produzierten, enthielten die Vesikel nur LNPs und kein eGFP, was stark darauf hindeutet, dass die LNPs in Vesikeln ohne Zytoplasma internalisiert worden waren (Abb. 3b, c und ergänzende Bildkontrolle, Abb. 4c). Wichtig ist, dass die Zugabe des Stoffwechselhemmers Natriumazid (1, 2,5 oder 10 mM), der auf die Atmungskette abzielt32, oder die Inkubation von Zellen bei 4 °C die Lokalisierung von LNP-LR beeinflussten (Abb. 3d, e und ergänzende Abb . 4d–i). Diese Bedingungen werden häufig verwendet, um die Endozytose durch Unterdrückung der Energieproduktion zu hemmen33,34. Unter solchen Bedingungen schienen sich die LNPs eher an der Zellmembran als im Inneren der Zelle anzusiedeln. Die hemmende Wirkung von Natriumazid und Inkubation bei 4 °C auf die Aufnahme von extrazellulärem Material durch L-Formen wurde mithilfe von D-TR quantifiziert, da die Erfassung der Aufnahme von LNP-LR zu selten war, um genau quantifiziert zu werden. Bemerkenswerterweise wurde eine signifikante Verringerung der D-TR-Aufnahme durch L-Formen in Gegenwart von 2,5 mM Natriumazid beobachtet (5,9 % gegenüber 1,9 % der Zellen, die eine D-TR-Aufnahme für die Kontrolle bzw. Natriumazid zeigten (zweiteilige z- Test, z = 3,111, einseitiges P <0,001) und die Inkubation von L-Formen bei 4 °C hemmten die D-TR-Aufnahme vollständig (Abb. 3f). Diese Ergebnisse stimmen mit einem Aufnahmeprozess in L-Formen überein energieabhängig, wobei äußeres Material durch einen Membraninvaginationsprozess internalisiert wird.

a, b Repräsentative Mikroaufnahmen der Lokalisierung von LNP-LR (Lipid-Nanopartikel mit 18:1 Liss Rhod PE; Magenta) in internen Vesikeln von Alpha (a; n = 5 Beobachtungen) und Alpha pIJ82-GFP (b; n = 2 Beobachtungen) nach einem Inkubationsexperiment über Nacht bzw. 3 Tagen bei 30 °C. c Dichteprofildiagramm der Grauwerte (Pixelintensität) der entsprechenden Linienauswahl von Alpha-pIJ82-GFP (b), inkubiert mit LNP-LR, was zeigt, dass eine Abnahme der zytoplasmatischen eGFP-Emission mit einer Zunahme der LNP-LR-Emission korreliert. d, e Lokalisierung von LNP-LR während der Inkubation mit Alpha bei 4 °C (d) oder in Gegenwart von 2,5 mM Natriumazid (NaN3) bei 30 °C (e) nach 0, 24 und 48 Stunden Inkubation . Ähnliche Ergebnisse wurden mit 1 und 10 mM Natriumazid erhalten (siehe ergänzende Abbildung 4). Bilder wurden aus einem Experiment erhalten. f Prozentsatz der Alpha-pIJ82-GFP-Zellen, die nach 3-tägiger Inkubation bei 30 °C (Kontrolle), in Gegenwart von 2,5 mM Natriumazid (NaN3) oder nach Inkubation bei 4 °C eine Aufnahme von Dextran-Texas Red (D-TR) zeigen. Für Natriumazid wurde eine signifikante Verringerung der D-TR-Aufnahme beobachtet (Zwei-Proportionen-z-Test, z = 3,111, einseitig, P = 0,00093) und nach Inkubation bei 4 °C wurde keine Aufnahme festgestellt (ND). Sternchen (***) zeigen P ≤ 0,001 an. Der Prozentsatz der Zellen mit D-TR-Aufnahme und die Gesamtzahl der analysierten Zellen werden für jede Bedingung angegeben und basieren auf kombinierten Zellzahlen aus zwei Wiederholungsinkubationen. Beachten Sie, dass die Inkubation von L-Formen mit Lipid-Nanopartikeln (durchschnittliche Größe 150 nm) zu ihrer Lokalisierung innerhalb interner Vesikel führt und dass die Aufnahme externer Partikel durch Inkubation bei 4 °C oder mit Natriumazid gehemmt wird. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um die Ultrastruktur und Zusammensetzung intrazellulärer Vesikel besser zu verstehen, wurden L-Formen mithilfe der 3D-kryorrelativen Licht- und Elektronenmikroskopie (Kryo-CLEM) abgebildet (Abb. 4a). Kryo-FIB-SEM (fokussierter Ionenstrahl – Rasterelektronenmikroskopie) ermöglicht die hochauflösende 3D-Bildgebung von L-Formen und inneren Vesikeln. Die kryogene Probenvorbereitung und Bildgebung stellen sicher, dass die L-Formen durch schnelles Einfrieren unter Hochdruckbedingungen, die die Umwandlung von Flüssigkeit in amorphes Eis ermöglichen, in einem nahezu nativen Zustand sichtbar gemacht werden35,36,37.

ein Beispiel für korrelierte Fluoreszenz- und Elektronenmikroskopaufnahmen von Alpha-pIJ82-GFP (Zen Connect-Bild), durchgeführt mit allen abgebildeten Zellen. Ein sowohl im Fluoreszenz- als auch im Elektronenmikroskop sichtbares finderTOP-Raster erleichtert die Ausrichtung zwischen den beiden Bildgebungsmodulen. Quadrate kennzeichnen verschiedene interessierende Bereiche, die mit höherer Auflösung abgebildet werden. FIB-SEM fokussierter Ionenstrahl – Rasterelektronenmikroskopie, FL-Fluoreszenzlicht. b Beispiel eines Bildes mit höherer Auflösung einer ausgewählten Region von Interesse (ROI), das viele fluoreszierende Zellen zeigt. c Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme der L-Form, dargestellt durch das weiße Kästchen in (b), die eine intrazelluläre dunkle Kugel (~1 μm, weißer Pfeil) zeigt, wie sie durchgeführt wurde, um alle Zellen von Interesse auszuwählen. Die X-, Y- und Z-Pfeile in (b–d) geben die 3D-Ausrichtung der abgebildeten Zelle an, wie sie im 3D-FIB-SEM beobachtet wird. d Rasterelektronenmikroskopisches (REM) Bild (SE, Inlens) der Zelle in (c) (Größe ~6 μm) mit einem Pfeil, der das innere Vesikel anzeigt (n = 1 Zelle). e Überlagerung von fünf aufeinanderfolgenden Scheiben (Rückstreubilder) der Zelle in (d). Einschub: Dichteprofildiagramm (weiß) der durchschnittlichen Grauwerte (Pixelintensität) für die Region im weißen Feld (n = 1 Zelle). f–i FIB-SEM-Schnitte, die verschiedene Arten interner Vesikel aus drei abgebildeten Zellen zeigen. Vesikel, die die Zellmembran von etwa 3,5 μm großen Zellen auskleiden (f, g). Sternchen kennzeichnen Vesikel in (f, g). Vesikelkomplex (h) mit unterschiedlicher Membrandicke der Vesikel, angezeigt durch weiße Pfeile. Siehe auch ergänzende Abbildung 7a und ergänzender Film 3. (i) Membranvorsprünge, wie durch einen weißen Pfeil angezeigt. j–q Analyse der miteinander verbundenen Vesikel der Zelle in (i) (n = 1). j–l Drei aufeinanderfolgende Schnitte, die die Interaktion verschiedener Vesikel zeigen. n–p zeigen jeweils eine stärkere Vergrößerung der Regionen in weißen Kästchen in j–l. m, q 3D-Segmentierung von n–p. Während einige der Vesikel intrazellulär liegen, ragen andere aus der Zelle heraus. Eine vollständige verbundene Vesikelstruktur wird in Grün (m, q) dargestellt und durch weiße Pfeile (i, j, l, m) angezeigt. Siehe ergänzende Abbildung 7b–d und ergänzender Film 4. Die Zelle in den Feldern h–q ist etwa 4 μm groß. r–u Regionen mit unterschiedlichem Kontrast (durch farbige Regionen angezeigt) sind mit schwarzen Partikeln ausgekleidet, die mutmaßliche Lipidkörper darstellen, wie für eine Zelle gezeigt (ähnliche Regionen wurden in drei Zellen beobachtet). Diese Zelle ist ca. 3,6 μm groß und bezieht sich auf Panel (g). Die Größenverteilung der schwarzen Partikel beträgt 25 bis 60 nm. Maßstabsbalken repräsentieren 500 nm, sofern nicht anders angegeben. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Nach dem Einfrieren unter hohem Druck wurden Zellen mit mutmaßlichen intrazellulären Vesikeln anhand interner dunklerer Regionen ohne zytoplasmatisches eGFP unter Verwendung von Alpha-pIJ82-GFP nachgewiesen (ergänzende Abbildung 5). Spezifische L-Formen (Auswahlbeispiel in Abb. 4b, c) wurden detailliert mit Kryo-FIB-SEM abgebildet. Die Verringerung des zytoplasmatischen eGFP entsprach tatsächlich dem Vorhandensein interner Vesikel, wie durch FIB-SEM nachgewiesen (Abb. 4c, d, weißer Pfeil), im Einklang mit früheren Ergebnissen (Abb. 2b). Darüber hinaus war die Zusammensetzung des Zytoplasmas und des Inhalts der inneren Vesikel unterschiedlich, gemessen mit dem energieselektiven Rückstreudetektor (ESB) von InLens, der einen Kontrast basierend auf der Verteilung schwererer Elemente liefert (Abb. 4e). Die Analyse der Pixelintensität ergab, dass das Kontrastniveau innerhalb des inneren Vesikels dem der extrazellulären Umgebung ähnelte, wohingegen das Zytoplasma einen höheren Kontrast aufwies. Darüber hinaus zeigte ein Überbelichtungsexperiment, dass das Vesikel die gleiche Kapazität zur Absorption der Elektronendosis hat wie das Medium außerhalb, anders als der Rest der Zelle (ergänzende Abbildung 6a, b). Diese Ergebnisse stützen die Feststellung, dass innere Vesikel extrazelluläres Medium enthalten und durch Membraninvagination gebildet werden (Abb. 2).

Weitere hochauflösende Bildgebung zeigte das Vorhandensein mehrerer interner Vesikel in einzelnen Zellen (Abb. 4f – i, ergänzende Abb. 6c – e). Die meisten nachgewiesenen Vesikel kleideten die Zellmembran aus (Abb. 4g und ergänzende Abb. 6c – e), variierten in Größe und Membrandicke (Abb. 4h) und könnten sogar in größeren Vesikeln vorhanden sein (Abb. 4h und ergänzende Abb. 7a). . Das Vorhandensein von Vesikeln in anderen Vesikeln wurde auch mithilfe der Fluoreszenzmikroskopie beobachtet (ergänzende Abbildung 3c, weißer Pfeil), was ein nicht fluoreszierendes Vesikel in einem größeren Vesikel zeigt, das D-TR einkapselt. Darüber hinaus konnte beobachtet werden, dass Vesikel aus der Zellmembran heraussprossen (Abb. 4i). Die 3D-Rekonstruktion der knospenden Vesikel auf der Grundlage der Konturverfolgung ergab, dass diese entweder eine Erweiterung eines inneren Vesikels waren oder mit inneren Vesikel verbunden blieben und einen Komplex bildeten (Abb. 4j – q, ergänzende Abb. 7a – d und ergänzende Filme 3). , 4).

In einigen Fällen enthielten Zellen intrazelluläre Regionen mit anderen Grauwerten als der Rest der Zelle (Abb. 4r – u). Diese Regionen hatten eine Größenverteilung von 300 bis 800 nm, kleideten die Zellmembran nicht aus und waren von dunklen Partikeln mit einem Durchmesser von etwa 25–60 nm umgeben. Es könnte möglich sein, dass es sich bei diesen dunklen Partikeln im Vergleich zu früheren Kryo-FIB-SEM-Beobachtungen um Lipidkörper handelt38,39. Eine mögliche Interpretation ist, dass es sich bei den inneren Regionen um Vesikel handelt, deren umschließende Lipidmembran teilweise abgebaut ist. Die Lipide und Lipidabbauprodukte könnten sich in Lipidtröpfchen angesammelt haben, die zu den beobachteten schwarzen Partikeln führen. Um den internen Vesikelabbau zu erfassen, wurde eine Zeitrafferaufnahme über Nacht an L-Formen durchgeführt, die zytoplasmatisches mCherry (alpha pRed*) exprimieren. Vesikel wurden durch das Fehlen von zytoplasmatischem mCherry identifiziert und Zellen wurden in verschiedenen Z-Höhen abgebildet, um zu bestätigen, dass das Vesikel nicht einfach seinen Standort verschoben hatte. Vesikelzerstörung wurde bei Verwendung von 2 Tage alten L-Formen beobachtet, die in frischem LPB-Medium resuspendiert wurden (Zusatzfilm 5). Zwei weitere Ereignisse der Vesikelzerstörung wurden erfasst, nachdem ein aufeinanderfolgender Zeitraffer an derselben Probe, jedoch mit unterschiedlichen Zellen, durchgeführt wurde (Ergänzungsfilme 6, 7). Alle abgebildeten Vesikel waren zu Beginn des Zeitraffers bereits in den Zellen vorhanden. Während die Zeit, die bis zur Vesikelzerstörung verging, stark schwankte (nach 1 Stunde oder nach 13 und 17 Stunden beim zweiten Experiment), erfolgte der Zerstörungsprozess selbst innerhalb von 15 Minuten, dem Zeitintervall zwischen aufeinanderfolgenden Bildern. Diese Erkenntnisse untermauern das Modell, dass innere Vesikel von L-Formen aufbrechen und auf diese Weise ihren Inhalt im Zytoplasma freisetzen können.

Diese Ergebnisse bestätigen weiterhin, dass die in den L-Formen von K. viridifaciens beobachteten inneren Vesikel externes Medium enthalten und durch die Einstülpung der Zellmembran gebildet werden können. L-Formen können mehrere Vesikel unterschiedlicher Größe enthalten und in einigen Fällen Cluster oder Komplexe von Vesikeln bilden, die aus der Zellmembran herausragen können. Interne Vesikel können nach dem Vesikelabbau ihren Inhalt in die Zelle abgeben. Diese Ergebnisse stützen ein Modell für die Aufnahme von Makromolekülen wie DNA durch Verschlingung, gefolgt von der Freisetzung der Ladung nach Vesikelzerstörung (Abb. 5).

Durch die Einstülpung der Zellmembran kommt es zur Bildung innerer Bläschen in L-Form. Wenn sich die Zellmembran nach innen wölbt, wird extrazelluläre Flüssigkeit, die DNA oder andere Makromoleküle enthält, eingeschlossen. Der dem Invaginationsprozess zugrunde liegende Mechanismus ist energieabhängig und könnte auf einer erhöhten Membransynthese und einer hohen Membranfluidität beruhen oder durch Proteine ​​vermittelt werden, die denen ähneln, die an der eukaryotischen Endozytose beteiligt sind, wie z. B. Zytoskelettproteine. DNA wird durch einen unbekannten Prozess aus inneren Vesikeln freigesetzt (angezeigt durch einen gestrichelten Pfeil), der eine Zerstörung der Vesikel zur Folge haben kann. Bild erstellt mit BioRender.com.

Die bakterielle Zellwand ist eine wichtige Schutzbarriere gegenüber der Umwelt, sorgt für Stressresistenz und ermöglicht den selektiven Durchgang von Molekülen. Allerdings hat sich in den letzten Jahren gezeigt, dass Bakterien unter bestimmten Bedingungen auch ohne diese Schicht gedeihen können. Eine längere Einwirkung von Umweltbelastungen wie z. B. zellwandschädigenden Wirkstoffen oder einem hohen osmotischen Druck kann die Bildung von L-Formen induzieren, die sich ohne ihre Zellwand effizient vermehren7. Die Folgen eines solchen Wand-defizienten Lebensstils der Bakterien für ihre Fähigkeit, DNA aufzunehmen, sind weitgehend unbekannt. Hier liefern wir Beweise dafür, dass L-Formen DNA und andere Makromoleküle durch Verschlingung und anschließende Bildung interner Vesikel aufnehmen können (Abb. 5).

Bekannte Mechanismen für HGT sind natürliche Transformation, Transduktion und Konjugation40. Diese Mechanismen erfordern hochentwickelte Maschinen, um den Transport von DNA durch die Zellhülle zu ermöglichen. Wir zeigen hier, dass wanddefiziente Zellen wie Protoplasten, S-Zellen und L-Formen von K. viridifaciens DNA mithilfe von PEG aufnehmen. Wichtig ist, dass L-Formen die einzigen Zellen ohne Wand sind, die eine konsistente spontane Transformation unter Verwendung von Plasmid-DNA ohne PEG erreichen. Bei Verwendung genomischer DNA ohne Verwendung von PEG wurde keine Transformation beobachtet. Dies ist wahrscheinlich auf die etwa 200-fach geringere Anzahl der verwendeten gDNA-Moleküle im Vergleich zur Plasmid-DNA sowie auf die Notwendigkeit einer doppelten Rekombination der genomischen DNA mit dem Chromosom für eine stabile Integration der Antibiotikaresistenzkassette zurückzuführen, was wahrscheinlich zu a führt geringere Transformationseffizienz.

Natürlich transformierbare Bakterien nutzen ein kanonisches und komplexes System zur DNA-Aufnahme durch die Zellwand und Zellmembran. Der letzte Schritt erfordert das DNA-bindende Protein ComEA und das porenbildende Kanalprotein ComEC, wobei Homologe in natürlich transformierbaren grampositiven und gramnegativen Arten vorkommen (z. B. ComE und ComA in N. gonorrhoeae). Die Störung eines dieser Proteine ​​führt typischerweise zu einer drastischen Verringerung oder sogar zum Ausbleiben der Transformation15,16,41,42. Allerdings hatte die Störung von Genen mit Homologie zu comEA und comEC in L-Formen von K. viridifaciens keinen Einfluss auf deren Fähigkeit, DNA aufzunehmen, was auf einen Mechanismus schließen lässt, der von der kanonischen natürlichen genetischen Transformationsmaschinerie unabhängig ist.

Endozytose ist ein grundlegender und stark regulierter Prozess in Eukaryoten, der an der Aufnahme von Nährstoffen, der Regulierung der Plasmamembranzusammensetzung, der Wahrnehmung der extrazellulären Umgebung und der Signalübertragung beteiligt ist43. Durch die Einstülpung der Membran und die anschließende Membranspaltung und Vesikelbildung können Zellen ein breites Spektrum an Ladungen wie Flüssigkeiten, Liganden, Plasmamembranproteine ​​und manchmal sogar ganze Bakterien verinnerlichen. Auf die Invagination folgt häufig die Weiterleitung der Ladung über den endosomalen Weg und der lysosomale Abbau26. Bestimmte Säugetierzellen können DNA aufnehmen, gefolgt von einer aktiven Genexpression44, die möglicherweise über Endozytose erfolgt, obwohl der genaue Mechanismus unklar ist45. Diese Arbeit zeigt, dass L-Formen einen Endozytose-ähnlichen Mechanismus für die Aufnahme von DNA verwenden, wobei die Membraneinstülpung zur Bildung intrazellulärer Vesikel führt, die während ihrer Bildung extrazelluläres Material einkapselten (Abb. 5). Durch diesen Prozess wurden nicht nur DNA, sondern auch andere Makromoleküle wie 3-kDa-Dextran und sogar 150-nm-Lipid-Nanopartikel eingekapselt, was stark darauf hindeutet, dass der Aufnahmeprozess unspezifisch ist. Der Aufnahmeprozess wird durch Bedingungen gehemmt, die die Stoffwechselaktivität und die Energieproduktion reduzieren. Interessanterweise berichtet eine ältere Studie auch über die Aufnahme von fluoreszierenden Dextranen in inneren Vesikeln von Bacillus subtilis L-Formen, die vermutlich über Endozytose in der flüssigen Phase erfolgen46.

Der genaue Mechanismus, der der Bildung intrazellulärer Vesikel in L-Formen zugrunde liegt, ist unbekannt, hängt jedoch möglicherweise von einer erhöhten Membrandynamik aufgrund einer übermäßigen Membransynthese ab6,47. Ein Ungleichgewicht im Zelloberflächen-zu-Volumen-Verhältnis aufgrund einer übermäßigen Membransynthese kann zur Bildung interner Vesikel in sphärischen E. coli- und B. subtilis-Formmutanten führen6,48. Innere Vesikel oder Vakuolen können auch in vergrößerten Protoplasten und Sphäroplasten (letztere enthalten eine äußere Membran) gebildet werden, die unter Bedingungen gehalten werden, die eine Zellmembranexpansion ermöglichen49,50. Tatsächlich könnte ein Mangel an übermäßiger Membranproduktion auch erklären, warum wir keine konsistente DNA-Aufnahme in Protoplasten und S-Zellen beobachteten, die beide ohne ihre Wand nicht in der Lage sind, sich zu vermehren. Wir können jedoch nicht ausschließen, ob Proteine, die denen ähneln, die an der eukaryotischen Endozytose beteiligt sind, wie Hüllproteine, Spaltungsmaschinen oder Zytoskelettproteine43, an der Bildung interner Vesikel in L-Formen beteiligt sind. Es muss jedoch beachtet werden, dass die L-Formen von B. subtilis für die Membranverformung und -proliferation nicht auf bekannte Zytoskelettproteine ​​angewiesen sind51.

Hochauflösende elektronenmikroskopische Aufnahmen zeigten mehrere innere Vesikel in Zellen der L-Form. Interessanterweise enthielten die L-Formen auch Regionen, die nicht von einer Membran umgeben waren, sondern mit dunkleren Flecken gesäumt waren. Diese dunklen Flecken, die durch die lokale Aufladung der Elektronen mit dem Material entstehen, wurden früher als Protein- oder Lipidkörper beschrieben38,39 und können möglicherweise von Abbauprodukten der Membran innerer Vesikel stammen. Der wahrscheinliche Zerfall innerer Vesikel wurde ebenfalls mithilfe von Zeitrafferaufnahmen erfasst. Dieser Zerfall würde zur Freisetzung der Vesikelladung in das Zytoplasma führen. Bei Eukaryoten kann das Entweichen von Therapeutika aus endosomalen Vesikeln durch bakterielle, virale und chemische Wirkstoffe oder durch Nanopartikel vermittelt werden52,53. Zu den Fluchtmechanismen gehören Porenbildung, Destabilisierung der Membran, Anschwellen von Nanopartikeln oder osmotischer Bruch. Hohe Saccharosewerte oder der Protonenschwammeffekt erleichtern den Einstrom von Protonen, gefolgt von der Anreicherung von Chloridionen und dem Einstrom von Wasser, was zum Platzen der Vesikel führt54,55. Die Ansäuerung der Endosomen erfolgt über membranlokalisierte vakuoläre ATPasen (V-ATPasen), die Protonen in die Vesikel pumpen56. Bakterien haben ähnliche Protonenpumpen, sogenannte F-ATPasen, auf ihrer Plasmamembran und wurden auf der Membran intrazellulärer Vesikel vergrößerter Protoplasten gefunden57. Angesichts der Komplexität bekannter Fluchtmechanismen sind weitere Untersuchungen erforderlich, um zu verstehen, wie interne L-Form-Vesikel zerfallen können, um ihren Inhalt in das Zytoplasma freizusetzen.

Moderne Lebensformen sind komplexe biologische Systeme, die sich wahrscheinlich aus viel einfacheren Zellen entwickelt haben. Zwei Modellsysteme zur Untersuchung mutmaßlicher früher Lebensformen sind Riesenlipidvesikel und L-Formen, da ihnen eine Zellwand und die biophysikalische Art der Proliferation fehlt8,9. Es wird angenommen, dass der horizontale Gentransfer eine entscheidende Rolle in der Entwicklung des frühen Lebens gespielt hat58. Dies könnte bei Zellen geschehen sein, die noch keine Zellwand entwickelt hatten, was eine genetische Rekombination nach Zellfusion oder blitzgesteuerter Elektroporation ermöglichte59,60, andere Mechanismen der HGT waren jedoch unbekannt. Interne Vesikel wurden in L-Formen anderer Bakterienarten beobachtet, wobei unterschiedliche Funktionen und Mechanismen der Vesikelbildung beschrieben wurden61,62. L-Formen von Listeria monocytogenes sind in der Lage, DNA-haltige innere Vesikel entlang der Innenseite der Zellmembran zu bilden, die bei ihrer Freisetzung metabolisch aktiv werden63,64, sowie durch Membraneinstülpung innere Vesikel zu bilden, die wahrscheinlich extrazelluläres Medium enthalten47. Darüber hinaus kann eine sekundäre Invagination der Vesikelmembran selbst dazu führen, dass Vesikel Zytoplasma enthalten und lebensfähige Nachkommen darstellen.

Interessanterweise zeigen Vorarbeiten, dass L-Formen von L. monocytogenes auch die Fähigkeit besitzen, extrazelluläre Plasmid-DNA aufzunehmen und sich ohne den Einsatz von PEG65 zu transformieren. Es ist nicht bekannt, dass diese Bakterienart auf natürliche Weise umwandelbar ist und sie über kein funktionelles Kompetenzsystem verfügt. Dies legt nahe, dass ein ähnlicher Endozytose-ähnlicher Mechanismus, wie er bei L-Formen von K. viridifaciens beobachtet wird, für die DNA-Aufnahme verantwortlich sein könnte. Diese Beispiele liefern zusätzliche Belege für die Existenz einer bakteriellen Endozytose.

Eine aktuelle Studie berichtet über Ähnlichkeiten zwischen kugelförmigen Mikrofossilien und wandlosen Protoplasten66. Wenn Protoplasten unter Bedingungen gezüchtet wurden, die den vermuteten Bedingungen des Archaikums nachahmen, der Zeit, in der sich Leben auf der Erde bildete, bildeten sich intrazelluläre Vesikel. Diese Vesikel wurden auch in 3,5 bis 2,4 Milliarden Jahre alten Mikrofossilien beobachtet, was darauf hindeutet, dass es in der Antike möglicherweise wandlose Zellen gab. Es ist jedoch zu beachten, dass aus wandlosen Bakterien auch wandlose Zellen entstehen können. Beispielsweise konnte gezeigt werden, dass wandlose Mykoplasmen durch degenerative Evolution von Bakterien mit Wänden abgeleitet sind67, und im Labor erzeugte L-Formen stammen ebenfalls aus Zellen mit Wänden. L-Formen waren möglicherweise nicht die Urzellen selbst, sondern dienten vielmehr als Modell für die Untersuchung mutmaßlicher früher Lebensformen. Daher schlagen wir vor, dass der bei L-Formen beobachtete Endozytose-ähnliche Prozess einen alten Mechanismus widerspiegelt, der zeigt, wie Urzellen vor der Erfindung der Zellwand neues genetisches Material und Nährstoffe durch Verschlingung erworben haben könnten.

Zusammenfassend zeigt unsere Arbeit, dass der dauerhafte Verlust der bakteriellen Zellwand die Aufnahme von DNA, Dextran und 150 nm großen Lipid-Nanopartikeln über die Bildung interner Vesikel ermöglicht. Die Einstülpung der Zellmembran führt zur Aufnahme äußerer Flüssigkeiten und anschließender Vesikelbildung. Schließlich kann es zu einer Zerstörung des Vesikels kommen, was zur Freisetzung der Ladung in das Zytoplasma führt. Dabei handelt es sich um einen energieabhängigen Prozess, der Ähnlichkeiten mit einer einfachen Form der Endozytose aufweist, wie sie bei Eukaryoten beobachtet wird. Zukünftige Studien sind erforderlich, um die molekularen Mechanismen hinter diesem Prozess besser zu verstehen.

Die in dieser Studie verwendeten Bakterienstämme und Plasmide sind in den Ergänzungstabellen 4 bzw. 5 aufgeführt. Bakterienzelllinien sind auf begründete Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich. Kitasatospora viridifaciens DSM4023968 wurde konfluent auf Maltose-Hefeextrakt-Medium (MYM) gezüchtet, um Sporen zu erhalten, die nach 3–4 Tagen Wachstum geerntet wurden69. Kurz gesagt, die Sporen wurden mit einem Wattestäbchen in MilliQ resuspendiert und durch eine mit Watte gefüllte Spritze filtriert. Die Sporen wurden in 20 % (v/v) Glycerin (G1345, Duchefa Biochemie) resuspendiert und bis zur Verwendung bei –80 °C gelagert. Für das Myzelwachstum in Flüssigkeit wurde K. viridifaciens über Nacht bei einer Dichte von 1 × 106 Sporen ml–1 in L-Phasen-Brühe (LPB) ohne Saccharose bei 200 U/min gezüchtet. Stämme wurden 2 Tage lang in LPB mit Saccharose (S0809, Duchefa Biochemie) bei 100 U/min gezüchtet, um die Bildung von S-Zellen7 zu induzieren. L-Formen wurden auf festem L-Phasen-Mediumagar (LPMA) oder flüssigem LPB7 gezüchtet. Flüssige Kulturen wurden mit Sporen für K. viridifaciens-Stämme oder mit einem gefrorenen Aliquot einer 1 bis 2 Tage alten L-Form-Kultur im Falle von L-Form-Stämmen beimpft. L-Formen wurden in Flüssigkultur für die chemische Transformation 3–4 Tage lang und für alle anderen Experimente 7 Tage lang gezüchtet, sofern nicht ausdrücklich angegeben. L-Formen wurden für Transformationstests auf 5–7,5 × 107 KBE ml–1 (basierend auf einer OD600 von 3 für 3 und 7 Tage alte Zellen und 0,2 für 1 Tag alte Zellen) und 2,5–5 × eingestellt 107 KBE ml−1 (OD600 von 2) für alle anderen Experimente mit 7 Tage alten Zellen. Alle Kitasatospora-Kulturen wurden bei 30 °C gezüchtet.

Bei Bedarf Antibiotika (100 µg ml−1 Ampicillin, K029, Roth; 25 µg ml−1 Chloramphenicol, C0113; Duchefa Biochemie; 5 µg ml−1 Thiostrepton, 598226, Calbiochem; 50 µg ml−1 Apramycin, A0164, Duchefa Biochemie 100 µg ml-1 Hygromycin B, K547, Amresco, mit Ausnahme von 200 µg ml-1 Hygromycin B für LB-Medium) wurden dem Kulturmedium zugesetzt. Escherichia coli-Stämme wurden auf festem oder flüssigem LB-Medium (unter Schütteln bei 250 U/min) bei 37 °CE gezüchtet. Coli JM10970 wurde für Klonierungszwecke und zur Gewinnung methylierter Plasmid-DNA verwendet, während E. coli ET12567/pUZ800271 zur Gewinnung methylierungsdefizienter Plasmid-DNA verwendet wurde DNA.

Alle PCRs wurden mit PFU oder Q5® High-Fidelity DNA-Polymerase (NEB) durchgeführt. Die in dieser Studie verwendeten Primer sind in der Ergänzungstabelle 6 aufgeführt. GeneRuler DNA Ladder Mix (SM0334, Thermo Scientific) wurde verwendet, um die Größe von DNA-Molekülen mittels Gelelektrophorese zu bestätigen. Um pFL-ssgB (Ergänzungstabelle 5) zu erstellen, wurde eine Hygromycin-Resistenzkassette unter Verwendung des Primerpaars Hyg_F-231_EEV und Hyg_R + 1237_HEV mit pMS8272 als Matrize amplifiziert. Die PCR-Produkte wurden mit EcoRV verdaut und in pWHM3-oriT73 kloniert, um pWHM3-oriT-hyg zu erzeugen (Ergänzungstabelle 5). Die 3'-Flanke von ssgB wurde aus pKR17 verdaut und unter Verwendung von XbaI und HindIII in pWHM3-oriT-hyg kloniert, um das endgültige Plasmid zu erzeugen. Alle Restriktionsenzyme wurden bei New England Biolabs bestellt.

pRK1 (Ergänzungstabelle 5) wurde durch Amplifikation der stromaufwärts gelegenen flankierenden Region von comEA durch PCR mit den Primern FL1-comEA/comEC-FW und FL1-comEA/comEC-REV erstellt, wodurch einzigartige EcoRI- und XbaI-Restriktionsstellen eingeführt wurden, während die stromabwärts gelegene flankierende Region von comEC, hergestellt durch Gensynthese (Baseclear, Leiden, Niederlande), wurde von XbaI- und HindIII-Stellen flankiert. Die flankierenden Regionen und die Apramycin-Kassette wurden in pWHM3-oriT unter Verwendung der EcoRI- und HindIII-Restriktionsstellen, durchsetzt mit einer Apramycin-Resistenzkassette, die flankierende XbaI-Stellen enthielt, kloniert, wodurch das endgültige Plasmid entstand. Die comEA/comEC-Deletionsmutante wurde im L-Form-Stamm alpha7 unter Verwendung von pRK1 erzeugt, das die Nukleotide +58 relativ zum Startcodon von comEA (BOQ63_029625) bis +2489 relativ zum Startcodon von comEC (BOQ63_029630) durch eine Apramycinresistenz ersetzte Kassette. Beachten Sie, dass die Genanmerkung von Streptomyces viridifaciens ATTC11989 (Zugang CP023698) verwendet wurde, um die mutmaßlich korrekten Start- und Stoppcodons für comEC zu bestimmen, was zur Genomposition 5.041.836 bis 5.044.433 auf CP090841 führte.

Um pIJ82-GFP zu erzeugen, wurde die Region, die das eGFP-Gen mit einem Gap1-Promotor enthält, aus pGreen74 unter Verwendung des Primerpaars Gap1_FW_BglII und Egfp_RV_EcoRI amplifiziert. Das resultierende PCR-Produkt wurde unter Verwendung von BglII und EcoRI in pIJ82 kloniert, um das endgültige Plasmid zu erzeugen.

Um neue L-Form-Stämme zu erzeugen, wurde die Transformation von Alpha mit Plasmid-DNA mithilfe einer chemischen Transformation auf Basis von Polyethylenglykol (PEG)10 erreicht, wie unten beschrieben. Plasmid-DNA wurde aus Escherichia coli ET12567/pUZ8002 isoliert, um methylierungsdefiziente DNA zu erhalten. Die L-Form-Stämme alpha pIJ82-GFP und alphaΔdivIVA pIJ82-GFP wurden durch chemische Transformation von alpha bzw. alphaΔdivIVA mit pIJ82-GFP und anschließende Selektion mit Hygromycin B erzeugt (Ergänzungstabelle 4). Die Stämme wurden durch den Nachweis der fluoreszierenden eGFP-Produktion mittels Fluoreszenzmikroskopie verifiziert. Der Stamm alphaΔcomEA/EC wurde durch chemische Transformation von alpha mit pRK1 und anschließender Selektion auf Apramycin erhalten (Ergänzungstabelle 4). Das anschließende Wachstum auf einem nicht selektiven Medium ermöglichte eine doppelte homologe Rekombination, die zum Ersatz der comEA/EC-Region durch eine Apramycin-Resistenzkassette führte, was zu Thiostrepton-empfindlichen, Apramycin-resistenten Zellen führte. Der Stamm wurde durch PCR unter Verwendung des Primerpaars ComEA_Apra_check_FW und ComEC_Apra_check_RV verifiziert, um den Ersatz der Region durch die Apramycin-Kassette zu bestätigen. Um die Deletion dieser Region weiter zu bestätigen, wurde eine PCR mit den Primerpaaren ComEC_Presence_Check_1_FW/RV und ComEC_Presence_Check_2_FW/RV durchgeführt, die Teile von comEC nur dann amplifizieren, wenn diese genomische Region noch vorhanden ist.

Genomische DNA wurde aus einer 5 Tage alten Kultur von alphaΔssgB7 mittels Phenol:Chloroform-Extraktion10 isoliert. Kurz gesagt, das Zellpellet wurde in 10,3 % (Gew./Vol.) Saccharose, enthaltend 0,01 M Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA, 20296.291, VWR Chemicals BDH), pH = 8, resuspendiert, gefolgt von der Lyse mit 10 % (Gew./Vol.) Natriumdodecylsulfat (SDS). , 20765.02, Serva). Es wurde eine Extraktion mit Phenol:Chloroform (1:1-Mischung aus Phenol, 10001173, Fisher BioReagents™ und Chloroform, 32211, Honeywell) durchgeführt und die Nukleinsäuren wurden mit Isopropanol (33539, Honeywell) ausgefällt. Das Pellet wurde in Tris-EDTA-Puffer (Trizma®-Basis, RDD008, Sigma-Aldrich) gelöst, gefolgt von einer RNase A- (EN0531, Thermo Fisher) und Proteinase K-Behandlung (19131, Qiagen). Die gDNA wurde mittels Phenol:Chloroform-Extraktion isoliert und mit absolutem Ethanol (5250501, Biosolve) präzipitiert, bevor sie in nukleasefreiem Wasser resuspendiert wurde. Fragmentierte gDNA wurde durch 12-minütiges Schlagen der intakten gDNA unter Verwendung von Glasperlen mit 2 mm Durchmesser in einem Mikro-Dismembrator U (Sartorius) bei 2000 U/min erhalten. Die chromosomalen DNA-Konzentrationen wurden mit dem Quant-IT™ Broad-Range dsDNA Assay Kit (Q33130, Invitrogen) verifiziert.

Der K. viridifaciens-Stamm DSM40239 wurde mit einer Dichte von 5 × 106 Sporen ml-1 in flüssigem TSBS:YEME-Medium (1:1) mit 0,5 % (Gew./Vol.) Glycin (G0709, Duchefa Biochemie) und 5 mM MgCl2 (M0533) inokuliert , Duchefa Biochemie). Die Kultur wurde 48 Stunden lang unter Schütteln bei 200 U/min gezüchtet, danach wurden Protoplasten hergestellt10. Für K. viridifaciens pIJ82-GFP und K. viridifaciens pRed* wurden 72-stündige Kulturen verwendet. Die Zellen wurden mit 10,3 % (w/v) Saccharose gewaschen, bevor die Lysozymbehandlung durch Zugabe von 10 mg ml-1 Hühnereiweiß-Lysozym (~ 70.000 U mg-1, 62971, Sigma-Aldrich) durchgeführt wurde. Die Zellen wurden 2–3 Stunden lang bei 100 U/min und 30 °C inkubiert, wonach Myzelfragmente durch Filtration durch einen Wattefilter von den Protoplasten getrennt wurden. Bei Bedarf wurden die Zellen durch Zentrifugation bei 1000 × g konzentriert.

S-Zellen wurden durch Filtration aus LPB-Kulturen isoliert7. Kurz gesagt, die Kultur wurde durch einen sterilen EcoCloth™-Filter (AMEC0003, Contec) filtriert und anschließend durch einen 5 µm Isopore™-Membranfilter (TMTP01300, Merck) geleitet. Die Zellen wurden durch sanfte Zentrifugation bei 1000 × g für 20 Minuten konzentriert, wonach 90 % des Überstands entfernt wurden. Das Zellpellet wurde vorsichtig in der restlichen Flüssigkeit resuspendiert. Um eine hohe Konzentration an S-Zellen auf spontane DNA-Aufnahme zu testen, wurde K. viridifaciens mit 1 × 107 Sporen ml−1 inokuliert und die Filtration wurde nur durch den EcoCloth™-Filter durchgeführt.

Frisch präparierte Protoplasten, S-Zellen, L-Formen oder Myzelzellen wurden vor der Transformation auf Eis gehalten. Für die chemische Transformation wurden 50 µl Zellen mit 1 µg pRed*75, 150 ng gDNA des Stammes alphaΔssgB, filtersterilisierten salzlysierten Zellen (35 ng DNA aus alphaΔssgB) oder MilliQ gemischt. Dann wurden 200 µl 25 % (w/v) PEG 1000 (14805-B, NBS Biologicals) in P-Puffer10 zu den Zellen gegeben, gefolgt von vorsichtigem Mischen und Verdünnen der Suspension in P-Puffer. Reihenverdünnungen wurden auf LPMA-Medium ausplattiert und nach 16- bis 18-stündiger Inkubation wurde eine Überschichtung mit 1 ml P-Puffer, der Antibiotika enthielt, durchgeführt. Koloniebildende Einheiten (KBE) wurden nach 7 Tagen für L-Formen und Myzel bzw. nach 14 Tagen für S-Zellen und Protoplasten gezählt. Die Transformanten wurden durch Ausstreichen auf einem selektiven Medium und Mikroskopie verifiziert.

Frisch vorbereitete Zellen wurden mit 30 ng µl-1 unmethylierter DNA (pRed* oder pFL-ssgB wie angegeben) oder MilliQ für 18–24 Stunden bei 100 U/min inkubiert, sofern nicht anders angegeben. Eine Endkonzentration von 100 oder 10 ng µl-1 intakter gDNA und 10 ng ul-1 für fragmentierte gDNA, isoliert aus alphaΔssgB, wurde in Kombination mit 1 und 7 Tage altem Alpha verwendet. Nach sorgfältiger Resuspension wurden Verdünnungen auf selektives und nichtselektives LPMA ausplattiert. Myzelzellen wurden in ähnlicher Weise auf MYM-Medium verdünnt. Koloniebildende Einheiten wurden nach 7-tägiger Inkubation bei 30 °C für L-Formen und Myzel und bis zu 14 Tagen für Protoplasten und S-Zellen bestimmt. Transformanten wurden durch Wachstum auf einem selektiven Medium und durch PCR (unter Verwendung der Primer Tsr_Hyg_FW1 und Tsr_Hyg_RV1) oder Mikroskopie verifiziert. Um die Transformationseffizienz zwischen den Stämmen zu vergleichen, wurden Zellen aus mindestens fünf Replikakulturen hergestellt. Die DNA-Aufnahme von S-Zellen wurde mit Filtrat getestet, das nach dem Standardverfahren gewonnen wurde, sowie mit konzentrierterem Filtrat, das durch Inokulation von 1 × 107 Sporen ml–1 und Filtration der Bakterienkultur nur durch den EcoCloth™-Filter erhalten wurde. Kolonieplatten wurden mit dem Epson Perfection V600 Photo-Scanner mit der Software Epson Scan Utility v3.9.2.0 bebildert.

Drei Replikatkulturen von 1, 3 und 7 Tage alten L-Formen oder frisch hergestellten Protoplasten wurden einem Laurdan-Farbstofftest als Maß für die Membranfluidität unterzogen23. Etwa 1 ml jeder Kultur wurde zunächst 10 Minuten lang bei 1000 × g zentrifugiert, um jegliche Spuren des Kulturmediums zu entfernen. Die Zellen wurden in 1 ml P-Puffer resuspendiert und auf eine OD600 von 0,6 eingestellt. 10 mM Laurdan-Stammlösung (6-Dodecanoyl-2-Dimethylaminonaphthalin, D250, Invitrogen) wurde in 100 % Dimethylformamid (DMF, D4551, Sigma-Aldrich) hergestellt und bei –20 °C in einem bernsteinfarbenen Röhrchen gelagert. Zu jeder 1 ml OD-angepassten Kultur wurde 1 µl Laurdan-Farbstoff bis zu einer Endkonzentration von 10 µM hinzugefügt. Anschließend wurden die Kulturen 10 Minuten lang im Dunkeln bei 30 °C unter Schütteln bei 100 U/min inkubiert. Die Zellen wurden dreimal mit P-Puffer mit 1 % Dimethylsulfoxid (DMSO, 41639, Sigma-Aldrich) gewaschen, um ungebundene Farbstoffmoleküle zu entfernen, bevor die Zellen im P-Puffer resuspendiert wurden. Etwa 200 µl dieser resuspendierten Kultur wurden in eine SensoPlate™ mit 96 Vertiefungen und schwarzem Glasboden (655892, Greiner Bio-One) aliquotiert. Pro Kultur wurden drei technische Replikate sowie pro Kulturzustand ein Replikat ohne Farbstoff zur Messung der Hintergrundfluoreszenz gemessen.

Die Probenanregung erfolgte bei 350 nm, gefolgt von der Erfassung der Fluoreszenzemission bei 435 und 490 nm, bestimmt mit einem Spark® Multimode-Mikroplattenlesegerät (Tecan) mit Sparkcontrol V3.1-Software. Nach Abzug der Hintergrundfluoreszenz wurde der generalisierte Polarisationswert (GP) unter Verwendung von Gleichung berechnet. (1):

Die nach der Berechnung erhaltenen Werte liegen im Bereich von –1 bis +1, wobei Werte näher bei –1 auf eine größere Fließfähigkeit hinweisen.

Die Vorbereitung der Zellen zur Quantifizierung der Membranfluidität durch Mikroskopie wurde wie folgt durchgeführt. Die Zellen wurden wie oben erwähnt gewaschen und OD-angepasst. Laurdan-Farbstoff (Stammkonzentration 10 mM) wurde zu 100 µl Kultur hinzugefügt, um eine Endkonzentration von 100 µM zu erhalten. Die Kultur wurde 5 Minuten lang bei 30 °C gehalten und im Dunkeln mit 100 U/min geschüttelt. Etwa 900 µl vorgewärmter P-Puffer mit 1 % DMSO wurden zugegeben und die Kultur zentrifugiert (1000 × g, 10 Min.), um alle ungebundenen Farbstoffmoleküle zu entfernen. Die Zellen wurden schließlich zur mikroskopischen Analyse in 100 µl P-Puffer resuspendiert. Ähnlich behandelte Zellen, jedoch ohne Laurdan-Farbstoff, wurden als Kontrolle für mikroskopische Messungen verwendet.

Fluoreszenzmarkierte Plasmid-DNA wurde mit dem Mirus Label IT® Cy™5 Labeling Kit (MIR 2725) gemäß den Angaben des Herstellers hergestellt. Aliquote markierter DNA (100 ng µl−1) wurden bis zur weiteren Verwendung bei −20 °C gelagert.

Alle Lipide (DLin-MC3-DMA76; Cholesterin, C8667, Sigma-Aldrich; Avanti Polar Lipids: DSPC, 850365, DMG-PEG2000, 880151, 18:1 Liss Rhod PE, 810150) wurden in einem Molverhältnis von 50/38,3 kombiniert /10/1,5/0,2 unter Verwendung von Stammlösungen (100 µM–10 mM) in Chloroform:Methanol (1:1-Mischung aus Chloroform, 22706, VWR Chemicals, und Methanol, 83638, VWR Chemicals). Organische Lösungsmittel wurden unter einem Stickstoffstrom verdampft und das verbleibende Lösungsmittel wurde im Vakuum für mindestens 1 Stunde entfernt. Anschließend wurde der Lipidfilm in EtOHabs (20821, VWR Chemicals) gelöst und ein 50 mM Citratpuffer (pH = 4, MilliQ; unter Verwendung von Zitronensäure, C0759, und tribasischem Natriumcitrat-Dehydrat, C7254; Sigma-Aldrich) hergestellt. Jede Lösung wurde in separate Spritzen gefüllt und mit einem mikrofluidischen Mischer mit T-Verbindung verbunden. Die Lösungen wurden in einem Flussverhältnis von Citratpuffer gegen Lipide im Verhältnis 3:1 gemischt (1,5 ml min−1 für Citratpuffer, 0,5 ml min−1 für Lipidlösungen), was eine Gesamtlipidkonzentration von 1 mM ergab. Nach dem Mischen wurde die Lösung direkt in eine 10k MWCO-Dialysekassette (Slide-A-Lyzer™, Thermo Scientific) geladen und über Nacht gegen 1× phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), enthaltend 137 mM NaCl (NAC02, Formedium), 2,7 mM, dialysiert KCl (1,04936, VWR Chemicals), 8 mM Na2HPO4 (1,06586, VWR Chemicals) und 2 mM KH2PO4 (60229, Sigma-Aldrich), über Nacht. Lipid-Nanopartikel (LNP-LR) sind auf begründete Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich. Alle Inkubationen mit LNPs wurden mit in LPB-Medium resuspendierten Zellen durchgeführt, wobei das Endvolumen der LNP-Lösung 25 % betrug.

Zubereitungen von Lipid-Nanopartikeln wurden auf folgende Weise charakterisiert (Ergänzungstabelle 8). Messungen der dynamischen Lichtstreuung (DLS) wurden mit einem Zetasizer Nano Series S (Malvern Instruments, Malvern, UK) durchgeführt. Der eingebaute HeNe-Laser arbeitet mit einer Wellenlänge von 633 nm und nutzt einen Detektor in einem Winkel von 173° (nichtinvasive Rückstreutechnologie). Die Messungen wurden mit einer Äquilibrierungszeit von 1 Minute in UV-Küvetten bei 25 °C aufgezeichnet. Zur Abschätzung des z-Durchschnittsdurchmessers (Intensitätsgewichtsmitteldurchmesser) und des Polydispersitätsindex (PDI) (relative Breite der Partikelgrößenverteilung) wurden Proben durch zehnfache Verdünnung mit 1× PBS hergestellt. Zur Abschätzung des Zetapotentials wurde die Probe mit 0,1× PBS verdünnt und in einem Zetasizer Nano Series SZ (Malvern Instruments, Malvern, UK) gemessen. Alle Daten wurden dreifach erhoben, um den Mittelwert zu ermitteln.

Der Nachweis der Fluoreszenzemission von Transformanten wurde mit einem Zeiss Axioskop A.1 durchgeführt, das mit einer Zeiss Axiocam 305-Farbdigitalkamera ausgestattet war, unter Verwendung des Filtersatzes 63 HE (Carl Zeiss, bestehend aus einem 572/25-nm-Bandpass-Anregungsfilter, einem 590-nm-Strahlteiler und 629). /62 nm Bandpass-Emissionsfilter) zur Erfassung der mCherry-Fluoreszenz. Einzelne Kolonien wurden mit einem Zeiss SteREO Discovery v. 8 abgebildet, der mit einem Schott VisiLED Ring Light S80-55 und einer Bresser MikroCam SP5.0 ausgestattet war. Zur Aufnahme der Bilder wurde die Bresser MikroCamLabII-Software verwendet. Alle anderen Mikroskopiearbeiten wurden mit einem konfokalen Zeiss LSM 900-Mikroskop mit Airyscan 2-Modul, Temperaturkontrollkammer und Zeiss Zen 3.1-Software (Blue Edition, Carl Zeiss Microscopy GmbH) durchgeführt, sofern nicht anders angegeben. Alle Anregungs- und Emissionseinstellungen für dieses Mikroskop sind in der Ergänzungstabelle 7 aufgeführt. Sofern nicht anders angegeben, wurden Mehrkanal- (DIC und Fluoreszenz) und Multistack-Bilder erhalten. 10 μl Zellen wurden auf einem 8-Kammer-Objektträger (ibidi®) abgebildet, der mit 0,1 % (w/v) Poly-L-Lysin (P8920, Sigma-Aldrich) beschichtet war; überschüssiges Poly-L-Lysin wurde entfernt und der Objektträger wurde zugelassen vor dem Auftragen der Probe trocknen lassen). Für die Zeitraffer-Bildgebung oder die Inkubation über Nacht in der Temperaturkontrollkammer wurden 400 μl Zellkultur in eine 35-mm-Bildgebungs-μ-Schale (ibidi®) gegeben und vor der Bildgebung über Nacht eine Stunde lang bei 30 °C ruhen gelassen. Die Bildanalyse wurde mit der Fiji-Software (ImageJ)77 durchgeführt.

Chromosomale DNA wurde nach 30-minütiger Inkubation mit SYTO 9 (S34854, Invitrogen) in einer Endkonzentration von 2 μM sichtbar gemacht. Zellmembranen wurden durch Inkubation mit SynapseRed C2M (SynapseRed, PK-CA707-70028, PromoKine, PromoCell GmbH) bei einer Endkonzentration von 40 μg ml–1 sichtbar gemacht. Nach der Inkubation über Nacht in einer μ-Dish (ibidi®) unter Verwendung der konfokalen Temperaturkontrollkammer Zeiss LSM 900 wurden die Zellen im Airyscan-Modus mit hochauflösender Nachbildverarbeitung über die Zen-Software abgebildet. Protoplasten und S-Zellen wurden bis zu 72 Stunden mit SynapseRed inkubiert, bevor sie auf einem Objektträger abgebildet wurden. Die Quantifizierung mutmaßlicher interner Vesikel wurde nach Inkubation von 7 Tage alten L-Formen (alpha pRed*) oder frisch geernteten S-Zellen und Protoplasten (K. viridifaciens pRed*), die zytoplasmatisches mCherry produzierten, mit SynapseRed für 0 oder 72 Stunden durchgeführt. SYTO 9 wurde direkt vor der Bildgebung hinzugefügt, um DNA zu identifizieren. Die Zellen wurden auf einen Objektträger mit acht Kammern (ibidi®) gelegt, der mit 0,1 % Poly-L-Lysin beschichtet war. L-Formen und S-Zellen wurden von oben nach unten mit einer Schrittgröße von 0,5 μm und Protoplasten mit einer Schrittgröße von 0,28 μm abgebildet, um ihre kleinere Zellgröße zu berücksichtigen. Zellen mit einer oder mehreren Regionen ohne mCherry-, SYTO 9- oder SynapseRed-Färbung wurden mit dem Cell Counter-Plugin in Fidschi (ImageJ) als Zelle mit einem mutmaßlichen inneren Vesikel gezählt.

Die Aufnahme fluoreszierend markierter DNA wurde durch Inkubation von Zellen mit Cy5-markierter Plasmid-DNA (pFL-ssgB) bei einer Endkonzentration von 1,25 μg ml−1 bewertet und nach 72 Stunden in einer μ-Dish (ibidi®) abgebildet.

Um die Bildung interner Vesikel und die Aufnahme von Dextran-Texas Red (D-TR, D-3329, 3000 MW, neutral, Molecular Probes) zu erfassen, wurden Zellen von Alpha-pKR2 mit einer Endkonzentration von 1 mg ml-1 D-TR in inkubiert PBS und wurden über Nacht abgebildet. Die Multistack-Bildgebung über eine Gesamtdistanz von 6 μm mit Schritten von 1,5 μm wurde durchgeführt, wobei alle 10 Minuten ein Bild aufgenommen wurde. Die Bildgebung der D-TR-Aufnahme in L-Formen, Protoplasten oder S-Zellen wurde nach einer Inkubation von bis zu 72 Stunden durchgeführt. Die Quantifizierung des Prozentsatzes der Zellen, die D-TR aufgenommen hatten, wurde wie folgt durchgeführt. Zellen, die zytoplasmatisches eGFP produzieren, wurden 72 Stunden lang mit PBS oder 1 mg ml-1 D-TR in Duplo inkubiert (7 Tage altes Alpha-pIJ82-GFP oder frisch geerntete S-Zellen oder Protoplasten von K. viridifaciens pIJ82-GFP). Die Zellen wurden zehnfach in LPB-Medium verdünnt und 10 Minuten lang vorsichtig bei 1000 × g zentrifugiert, wonach der Überstand durch LPB-Medium ersetzt wurde. Die Zellen wurden auf einen Objektträger mit acht Kammern (ibidi®) gelegt, der mit 0,1 % Poly-L-Lysin beschichtet war. Z-Stapelbilder wurden von oben nach unten der Zellen in Schritten von 0,28 μm aufgenommen. Zellen mit mutmaßlicher D-TR-Aufnahme wurden als solche identifiziert, denen eine Region des zytoplasmatischen eGFP (mutmaßliche innere Vesikel) fehlte, während sie eine erhöhte D-TR-Emission in dieser Region zeigten, gemessen mit dem Plot Profile-Tool in Fidschi (ImageJ). Zellen mit und ohne Aufnahme wurden mit dem Cell Counter-Plugin in Fidschi (ImageJ) gezählt.

Die Aufnahme rot fluoreszierender LNPs (LNP-LR) durch Alpha wurde durch Bildgebung nach Inkubation über Nacht in einer μ-Schale (ibidi®) oder nach Inkubation für bis zu 3 Tage vor der Bildgebung wie angegeben sichtbar gemacht. Die Hemmung der LNP-Aufnahme wurde durch Inkubation in Gegenwart von 1, 2,5 oder 10 mM Natriumazid (S-8032, Sigma-Aldrich) oder Inkubation bei 4 °C durchgeführt, und Bilder wurden über die Zen-Software nach 0, 24, und 48 Std. Um die subzelluläre Lokalisierung von LNP-LR in Alpha-pIJ82-GFP zu bestimmen, wurde die Bildgebung im Airyscan-Modus mit hochauflösender Nachbildverarbeitung durchgeführt und anhand der Pixelintensität der roten (LNP-LR) und grünen (eGFP) Kanäle analysiert mit dem Plotprofil-Tool in Fidschi (ImageJ).

Um die Membranflüssigkeit zu messen, wurden Proben mit einem 405-nm-Laser angeregt und Bilder wurden bei Emissionen von 430 und 500 nm aufgenommen. Der GP-Wert wurde mit dem Plugin „Calculate GP“ in Fiji78 berechnet, um ein Histogramm der Pixelanzahl im Bereich von –1 bis +1 zu erhalten. Kurz gesagt wird das Bild in einzelne Kanäle aufgeteilt, gefolgt von einer Hintergrundsubtraktion und dem Setzen der nicht signifikanten Pixel auf Null. Den Bildern werden dann die Buchstaben A und B zugewiesen, um mit dem Bildrechner A − B und A + B zu berechnen. Schließlich wird ein Verhältnis von (A − B)/(A + B) als Bild angezeigt, bei dem die minimalen Pixelwerte auf −1 (rot) und die maximalen Pixelwerte auf +1 (blau) festgelegt sind. Mit der Funktion „Histogramm analysieren“ wird eine Werteliste erstellt und zum Zeichnen der Verteilungen verschiedener Stichproben verwendet.

Um die Vesikelstörung zu erfassen, wurden L-Formen in frischem LPB bis zu einer OD600 von 0,04 resuspendiert. Die Verdünnungen wurden in eine SensoPlate mit 96 Vertiefungen und schwarzem Glasboden gegeben und 5 Minuten lang vorsichtig bei 1000 × g zentrifugiert, um die Zellen am Boden der Vertiefungen abzusetzen. Die Zellen wurden unter Verwendung eines automatisierten Lionheart FX-Mikroskops (BioTek) mit der Software Gen 5 v.3.10 bei einer 60-fachen Vergrößerung in Luft (Hellfeld und mCherry unter Verwendung eines Texas Red 586/647-Filterwürfels) abgebildet. Z-Stapel-Bilder wurden alle 15 Minuten mit einer Schrittgröße von 1 µm über insgesamt 12 µm für 20 Stunden (Zusatzfilm 5) oder einer Schrittgröße von 0,5 µm über insgesamt 5 µm über 17,5 Stunden (Zusatzfilme 6, 7) aufgenommen.

Der sieben Tage alte L-Form-Stamm alpha pIJ82-GFP, der zytoplasmatisches eGFP exprimiert, wurde in frischem Medium mit 25 % (v/v) PBS und einer Endkonzentration von 17 % (w/v) Saccharose auf eine OD600 von 2 eingestellt. Die Zellen wurden 4 Tage lang inkubiert, wobei sich die Zellen am Boden absetzten. Einige Mikroliter des resuspendierten Pellets in L-Form wurden zwischen HPF-Trägern (Hochdruckgefrieren) mit 2 mm Innendurchmesser (entweder 0,1 mm oder 0,05 mm Hohlraum, Art. 241 bzw. Art. 390, Wohlwend) und maßgeschneiderten Behältern eingelegt. Angefertigtes Gitter mit Beschriftung, flache Seite finderTOP (Alu-Plättchen beschriftet, 0,3 mm, Art.1644 Wohlwend), um einen Abdruck einer Findermatrix auf dem amorphen Eis zu ermöglichen79. Das finderTOP wurde vor dem Einfrieren mit 1 % l-α-Phosphatidylcholin (61755, Sigma-Aldrich) in Ethanol (1.00983.1000, Supelco) behandelt. Anschließend wurden die Proben unter hohem Druck eingefroren (Live µ, CryoCapCell) und bis zur Bildgebung in flüssigem Stickstoff gelagert.

Um die Korrelation zwischen Kryo-Licht- und Kryo-Elektronenmikroskopie zu verbessern, wurden die gefrorenen Proben mithilfe der ZEISS Correlative Cryo Workflow-Lösung in einen universellen Kryohalter (Art. 349559-8100-020, Zeiss Kryo-Zubehörset) geladen, der in den passt PrepDek® (PP3010Z, Quorum Technologies, Laughton, Großbritannien). Dabei passt der HPF-Träger in einen universellen Kryohalter, der anschließend in einen Adapter speziell für Kryo-Licht- oder Kryo-Elektronenmikroskopie eingesetzt werden kann.

Die gefrorenen Proben wurden mit einem Kryotischadapter (CMS-196, Linkam Scientific Inc.) abgebildet, der an einem aufrechten konfokalen Mikroskop (LSM 900, Zeiss Microscopy GmbH) angebracht war, das mit einem Airyscan 2-Detektor ausgestattet war. Übersichtsbilder (Zeiss C Epiplan-Apochromat 5×/0,2 DIC) wurden mit Reflexionsmikroskopie erstellt, um das Gittermuster auf der Eisoberfläche sichtbar zu machen. Als nächstes wurden Z-Stapelbilder mittlerer Auflösung (Zeiss C Epiplan-Apochromat 10×/0,4 DIC) mit einem 488-nm-Laser (0,4 %) mit einer Voxelgröße von 0,15 µm × 0,15 µm × 1,18 µm aufgenommen. Mit dieser Auflösung konnten interessierende Zellen ausgewählt und Z-Stapelbilder erstellt werden (Zeiss C Epiplan-Neofluar 100x/0,75 DIC) unter Verwendung eines 488-nm-Lasers (4 %) mit einer Voxelgröße von 0,08 µm × 0,08 µm × 0,44 µm. Zusätzlich wurde die Eisoberfläche in allen ROIs mit Reflexionsmikroskopie zu Korrelationszwecken im FIB-SEM abgebildet.

Vor der Kryolicht-Bildgebung wurde ein Zeiss ZEN Connect-Projekt (Zeiss-Software für korrelative Mikroskopie, Version 3.1) erstellt, um ein Arbeitsblatt (Leinwand) zu erstellen, um alle Bilder auszurichten und zu überlagern und die weitere Korrelation mit Kryo-FIB-SEM zu erleichtern .

Die Probe wurde 30 s lang mit Platin bei einem Strom von 5 mA sputterbeschichtet, wobei der Vorbereitungsstufen-Sputterbeschichter (PP3010, Quorum Technologies, Laughton, England) verwendet wurde, und in den Zeiss Crossbeam 550 FIB-SEM (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Oberkochen) überführt , Deutschland) unter Verwendung der Vorbereitungskammer PP3010T (Quorum, Laughton, England). Während der gesamten Bildgebung wurden die Proben bei –140 °C gehalten und der Systemvakuumdruck betrug 1 × 10–6 mbar.

Nach dem Einsetzen der Probe in die FIB-REM-Kammer wurden mit dem REM Übersichtsbilder aufgenommen, um die Daten mit dem LSM-Reflexionsbild der Oberfläche desselben ZEN Connect-Projekts abzugleichen. Diese Ausrichtung ermöglicht die Bühnenregistrierung, die es ermöglicht, mithilfe des Fluoreszenzsignals zu verschiedenen interessierenden Regionen zu navigieren. Nach der anfänglichen Ausrichtung mit dem SEM wurde ein FIB-Bild der Oberfläche mit der 30 kV@10 pA-Sonde bei 54° Neigung aufgenommen.

Zur SEM-Beobachtung wurde mit der 30 kV@30 nA FIB-Sonde ein grober Graben gefräst. Die Kaltabscheidung erfolgte mit Platin für 30 s. Das feine FIB-Fräsen des Querschnitts wurde mit der 30 kV@700 pA-Sonde durchgeführt. Für das serielle FIB-Fräsen und die SEM-Bildgebung betrug die Schnittbreite (Grabenbreite) 40 μm und für das FIB-Fräsen wurde die 30 kV@300 pA-Sonde mit einer Schnittdicke von 20 nm verwendet. Als eine neue Schnittoberfläche durch FIB-Fräsen freigelegt wurde, wurden gleichzeitig ein InLens-Sekundärbild und ein EsB-Bild bei einem Beschleunigungspotential von 2,33 kV und einem Sondenstrom von 250 pA aufgenommen. Das EsB-Gitter wurde auf –928 V eingestellt. Die Bildgröße wurde auf 2048 × 1536 Pixel eingestellt. Zur Rauschunterdrückung wurde ein Zeilendurchschnitt mit einer Zeilendurchschnittszahl N = 46 bei Scangeschwindigkeit 1 verwendet. Die Voxelgröße aller Stapel betrug 5 nm3 × 5 nm3 × 20 nm3.

Die Kryo-FIB-SEM-Bilder wurden mit MATLAB (R2018b, Natick, Massachusetts: The MathWorks Inc.) verarbeitet, um Fehler wie Curtaining, Fehlausrichtung und lokale Aufladung zu korrigieren. Für die anschließende Rauschunterdrückung und Kontrastverstärkung wurde dieselbe Software verwendet. Eine Zusammenfassung der einzelnen Verarbeitungsschritte lautet wie folgt:

Das Entfernen der vertikalen Streifen in den Stapeln erfolgte nach einem Wavelet-FFT-Filterungsansatz80. Kurz gesagt, die den vertikalen Streifen entsprechenden Hochfrequenzinformationen wurden mithilfe der Zerlegung durch die Coif-Wavelet-Familie sukzessive zu einer einzigen Koeffizientenkarte verdichtet. Anschließend wurde eine 2D-Fourier-Transformation durchgeführt, um die Streifeninformationen weiter in schmale Bänder zu verkleinern. Schließlich wurde die komprimierte Streifeninformation durch Multiplikation mit einer Gaußschen Dämpfungsfunktion eliminiert und das zerstörte Bild durch inverse Wavelet-Transformation rekonstruiert.

Die aufeinanderfolgenden Schichten wurden mithilfe normalisierter Kreuzkorrelation ausgerichtet. Kurz gesagt wurde das erste Bild im Stapel als Referenz ausgewählt und das zweite Bild Pixel für Pixel über die Referenz verschoben und eine normalisierte Kreuzkorrelationsmatrix mithilfe der Funktion normxcorr2 erhalten. Anschließend wurde der Ort des höchsten Peaks in der Kreuzkorrelationsmatrix (der die beste Korrelation darstellt) zur Berechnung der zum Ausrichten der beiden Bilder erforderlichen Übersetzung verwendet. Sobald das bewegte Bild mit dem Referenzbild ausgerichtet war, diente es als Referenz für die Ausrichtung der nachfolgenden Schicht.

Die Beseitigung des lokalen Ladungsungleichgewichts wurde durch anisotrope Gaußsche Hintergrundsubtraktion erreicht. Kurz gesagt wurde die Funktion imgaussfilt verwendet, um eine 2D-Gaußsche Glättung mit einem Standardabweichungsvektor mit zwei Elementen durchzuführen. Die Elemente im Vektor wurden so ausgewählt, dass in horizontaler bzw. vertikaler Richtung eine breite und scharfe Gaußsche Kurve angewendet wird. Anschließend wurde das korrigierte Bild durch Subtrahieren des gefilterten Bildes vom Originalbild erhalten.

Um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern, wurde eine Rauschreduzierung mithilfe einer anisotropen Diffusionsfilterung81 durchgeführt. Kurz gesagt, mithilfe der imdiffuseest-Funktion wurden der optimale Gradientenschwellenwert und die Anzahl der zum Filtern jedes Bilds erforderlichen Iterationen geschätzt. Anschließend wurde die Funktion imdiffusefilt mit den geschätzten optimalen Parameterwerten angewendet, um jedes Bild zu entrauschen.

Als letzten Verarbeitungsschritt wurde der Kontrast mithilfe der kontrastbegrenzten adaptiven Histogrammentzerrung82 verbessert. Mit der adapthisteq-Funktion wurde der Kontrast in zwei Schritten verstärkt, wobei eine gleichmäßige Verteilung und eine niedrige Clipping-Grenze verwendet wurden, um eine Überverstärkung homogener Bereiche zu vermeiden.

Zur Segmentierung aller Bilddaten wurde die Bildanalyse- und Deep-Learning-Software DragonflyTM (Version 2021.1, Objects Research Systems, Montreal, QC, Kanada) verwendet.

Proteinsequenzen aus Bacillus subtilis str. 168, Neisseria gonorrhoeae und Helicobacter pylori-Stamm P12 wurden aus der UniProt-Datenbank oder der Literatur bezogen und sind in Supplementary Data 1 bereitgestellt. Protein BLAST wurde für diese Sequenzen gegen die übersetzte Kodierungssequenzdatenbank des Streptomyces viridifaciens-Stammes DSM40239 (auch bekannt als K. viridifaciens-Stamm DSM40239) mit den Sequenzzugangsnummern CP090840, CP090841 und CP090842 unter Verwendung der Offline-BLAST-Software (Version 2.12.0). Treffer mit einem E-Wert von 1 × 10−6 oder niedriger wurden gesammelt (Ergänzungstabelle 1).

Alle Statistiken sind angegeben und wurden mit der Statistiksoftware SPSS (IBM, Version 27.0) durchgeführt, mit Ausnahme des Zwei-Proportionen-Z-Tests, der manuell berechnet wurde. P-Werte unter 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen. Die Testannahmen wurden mit den folgenden Methoden ermittelt. Die Homogenität der Varianzen wurde mit dem Levene-Test getestet. Die Normalität wurde mithilfe des Kolmogorov-Smirnov-Tests, des Shapiro-Wilk-Tests und gegebenenfalls von QQ-Diagrammen getestet. Diagramme wurden mit Graphpad Prism v. 9.0.0 oder mit R Version 3.6.1 erstellt, und andere grafische Bilder wurden mit Adobe Illustrator v. 26.3.1 oder über Biorender.com (Zugriff im August 2022) erstellt. Standardabweichungen wurden über Graphpad Prism berechnet und dargestellt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Proteinsequenzen, die aus der UniProt-Datenbank oder der Literatur zur Durchführung der NCBI BLAST-Suche erhalten wurden, sind in den Zusatzdaten 1 mit Zugangsnummern versehen. Alle Fluoreszenz- und FIB-SEM-Mikroaufnahmen in diesem Artikel, einschließlich der rohen FIB-SEM-Daten, die der 3D-Segmentierungsvolumendarstellung zugrunde liegen ( Ergänzende Filme 3, 4) sowie die mikroskopischen Aufnahmen, die für die Quantifizierung der Vesikel- und D-TR-Aufnahme in Abb. 3f und den ergänzenden Tabellen 2 und 3 verwendet wurden, wurden in der Open Science Framework (OSF)-Datenbank hinterlegt, die unter https:// verfügbar ist. doi.org/10.17605/OSF.IO/5WKGJ. Für die BlastP-Suche wurden Treffer vom Streptomyces viridifaciens-Stamm DSM40239 mit den Zugangsnummern CP090840, CP090841 und CP090842 gesammelt. Streptomyces viridifaciens ATTC11989 (Zugangsnummer CP023698) wurde verwendet, um das mutmaßliche K. viridifaciens comEC-Start- und Stoppcodon für das Gen-Knockout-Konstrukt abzuleiten. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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RK und LZ werden durch das TARGETBIO-Programm der niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO) unterstützt, Fördernr. 15812. SS wird durch das Vici-Stipendium der Niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO) an DC unterstützt, Stipendien-Nr. VI.C.192.002. Im Rahmen des COFUND-Projekts oLife erkennt DA die Finanzierung durch das Forschungs- und Innovationsprogramm Horizon 2020 der Europäischen Union im Rahmen der Fördervereinbarung 847675 an. MdB, RR, DD und AA werden durch einen ERC Advanced Investigator Grant (H2020-ERC-2017-ADV) unterstützt -788982-COLMIN). AA wird auch von der NWO unterstützt (VI.Veni.192.094). Wir danken Nico Sommerdijk (Radboudumc, Electron Microscopy Center) für seinen Beitrag zum Hochdruckgefrieren der Proben. Wir danken Gerda Lamers und Joost Willemse für ihre freundliche Spende von Dextran-Texas Red.

Institut für Biologie, Universität Leiden, Sylviusweg 72, 2333, Leiden, Niederlande

Renée Kapteijn, Shraddha Shitut, Le Zhang, Gilles P. van Wezel und Dennis Claessen

Abteilung für supramolekulare Chemie und Biomaterialchemie, Leiden Institute of Chemistry, Universität Leiden, Einsteinweg 55, 2333, Leiden, Niederlande

Dennis Aschmann & Alexander Kros

Zentrum für Elektronenmikroskopie, Radboudumc Technology Center Microscopy, Nijmegen, Niederlande

Marit de Beer, Deniz Daviran, Rona Roverts und Anat Akiva

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RK und SS führten die Experimente durch. LZ, SS und RK erstellten die Plasmide und DA lieferte die Lipid-Nanopartikel. AA, MdB, RR und DD führten die FIB-SEM-Bildgebung und -Analyse durch. Alle Autoren trugen zur Gestaltung der Experimente und zur Diskussion der Ergebnisse bei. RK, DC und AA haben das Manuskript unter Mitwirkung aller Autoren verfasst.

Korrespondenz mit Gilles P. van Wezel oder Dennis Claessen.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Angel Manteca, Katarzyna Mickiewicz und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Kapteijn, R., Shitut, S., Aschmann, D. et al. Endozytose-ähnliche DNA-Aufnahme durch Bakterien mit Zellwandmangel. Nat Commun 13, 5524 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-33054-w

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Eingegangen: 16. Februar 2022

Angenommen: 31. August 2022

Veröffentlicht: 22. September 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-33054-w

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